Identification of novel mutations and their functional roles of the human ATP7B gene in Korean patients with Wilson disease

Abstract

[한글]

윌슨병은 상염색체 열성 질환으로 구리수송에 문제가 발생되어 간과 주변장기에 과도한 구리가 침착되어 일어나는 질병이다. 손상된 구리의 담즙방출과 구리와 세룰로플라즈민의 결합 장애로 인해 윌슨병의 주증상인 간경변과 정신지체를 유발시킨다. ATP7B 유전자는 윌슨병의 원인 유전자로써 21개의 엑손과 165kDa의 P형 구리소송 ATPase 단백질을 코딩한다. 한국인의 윌슨병 환자를 대상으로 ATP7B 유전자 돌연변이 검사를 실시하였다. 125명의 혈연관계가 없는 한국인의 윌슨병 환자중에서 30개의 서로 다른 돌연변이를 밝혀냈다 (p.R778L, p.A874V, p.N1270S, c.2513delA, p.T1029I, p.G1035V, p.L1083F, c.2630_2656del, c.2304_2305insC, p.R919G, p.V1106I, p.D1267A, p.C108R, p.E412X, p.C656X, p.M729V, p.R778Q, p.G891D, p.I929V, p.G943S, p.P992L, p.V1024A, p.T1031A, p.C1091Y, p.I1148T, p.A1168S, p.G1186S, p.V1216M, p.P1273L, c.1543+1 G>T). 새롭게 밝힌 돌연변이로 인한 ATP7B 단백질의 기능적 결함을 평가하기 위해, yeast 매개 시스템과 공촛점 현미경을 사용하여 포유동물 세포에 한시적인 발현을 통해 돌연변이들의 단백질 발현 위치를 분석하였다. 5개의 새 돌연변이들은 yeast 발현벡터인 pSY114와 포유동물 발현벡터인 pEGFPC1에 클론하였다. Yeast 매개 시스템에서 p.C656X, p.T1029I, p.T1031A 돌연변이는 단백발현의 이상으로 인해 철 흡수 친화력이 감소되어 yeast의 ccc2 기능을 회복시킬 수 없었다. 이는 ATP7B 단백질의 구리수송 유전자 기능의 결함이 있음을 나타내 주는 결과이다. 임상적으로 증상이 경한 환자인 p.G891D 돌연변이의 단백발현은 yeast의 △ccc2기능을 부분적으로 회복하였다. p.V1106I 돌연변이의 단백발현은 정상인처럼 완벽하게 구리 수송 단백질을 회복시켰다는 점에서 돌연변이라기보다는 다형태라고 판단된다. 공촛점 현미경을 이용한 ATP7B 단백질의 돌연변이 발현 추적 결과, p.C656X 돌연변이의 단백질 발현은 COS-7 숙주세포에서 광범위하게 흩어져 발현되는 양상을 띄었다. p.G891D 돌연변이 단백질은 부분적으로 trans-Golgi 부위에서 발현되었다. 그리고 p.T1029I, T1031A 2가지 돌연변이는 주로 핵 주위에서 발현되어 그 주변의 세포 소기관에 잘못 위치하였다. 한편, p.V1106I는 정상적인 ATP7B 단백질 발현 장소와 같은 곳에서 일어났으며, 이러한 결과는 yeast 매개 시스템의 결과와 일치하였다. 윌슨병 환자의 ATP7B 단백질의 기능적인 결함과 유전형-표현형간의 상관관계를 규명하는데 yeast 매개 시스템과 공촛점 현미경 실험결과가 ATP7B 단백질의 기능연구에 유용한 수단으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.

[영문]Wilson disease (WND), an autosomal recessive disorder of copper transport, is characterized by excessive accumulation of intracellular copper in the liver and extrahepatic tissues. Due to the impaired biliary copper excretion and disturbed incorporation of copper into the ceruloplasmin, hepatic cirrhosis and neuronal degeneration are major symptoms in WND. The ATP7B, identified as the gene responsible for WND, has 21 exons and encodes 165 kDa copper transporting P-type ATPase. Screening of ATP7B mutation was performed in Korean patients with WND. Among the 125 unrelated Korean patients with WND, thirty different mutations were identified, including p.R778L, p.A874V, p.N1270S, c.2513delA, p.T1029I, p.G1035V, p.L1083F, c.2630_2656del, c.2304_2305insC, p.R919G, p.V1106I, p.D1267A, p.C108R, p.E412X, p.C656X, p.M729V, p.R778Q, p.G891D, p.I929V, p.G943S, p.P992L, p.V1024A, p.T1031A, p.C1091Y, p.I1148T, p.A1168S, p.G1186S, p.V1216M, p.P1273L and c.1543+1 G>T and ten novel mutations were identified. In order to evaluate the functional defects of ATP7B protein caused by novel mutations, yeast complementation system and confocal microscope were used for analyzing the localization of mutants after transient expression in mammalian cell system. Five novel mutations, p.C656X, p.G891D, p.V1106I, p.T1029I, and p.T1031A were constructed into the yeast expression vector, pSY114 and the mammalian expression vector, pEGFPC1. Three novel mutant, p.C656X, T.1029I and p.T1031A, were unable to rescue the △ccc2 mutant yeast due to the reduced affinity iron uptake in the yeast complementation system, indicating their defective ATP7B function. A novel mutation found in a patient with less severe symptom, p.G891D partially restored △ccc2 mutant yeast. A p.V1106I was completely restored as wild type which suggested p.V1106I was not a mutation, but a polymorphism. In the trafficking of the mutant ATP7B with confocal microscope, the mutant p.C656X was dispersedly throughout transfected COS-7 cells. The mutant p.G891D was partially localized to the site of the trans-Golgi network. Two mutants, p.T1029I and p.T1031A were predominantly mislocalized to perinuclear regions. A mutant p.V1106I was normally targeted to the trans-Golgi network, which was concordant with the result in the yeast complementation system. In characterizing functional defects of ATP7B and correlate genotype-phenotype in patients with WND, yeast complementation system and confocal microscopic evaluation were useful tools for functional study on mutant ATP7B protein.