The role of agmatine and arginine decarboxylase in ischemic tolerance after transient cerebral ischemia in rat models

Abstract

[한글]아그마틴은 생체 내에서 자체적으로 생성되는 clonidine-displacing substance로, alpha 2-adrenergic 그리고 imidazoline 수용기에 결합하는 내재성 ligand이며, NO생성에 대한 endogenous regulator로의 기능이 알려져 있다. 아그마틴은 L-arginine 과 구조적으로 유사하여 경쟁적 억제자(competitive inhibitor)로 작용할 수 있으며 일시적 국소 뇌허혈 손상 모델에서 일시적 뇌허혈 손상 후 재관류 4시간 후에 투여하였을 때에도 허혈 손상에 대한 신경보호효과를 나타냄이 보고된 바 있다.Ischemic preconditioning (IP) 이란 일종의 적응 반응으로, 조직을 약한 허혈(1시간 미만)에 미리 노출시킨 경우, 그 후의 강한 지속적인 허혈(chronic ischemia) 손상을 받게 되었을 때, 손상이 줄어드는 현상을 말한다. 본 연구는 아그마틴이 preconditioning 에 관여하는 역할을 규명하고자 하였다. Ischemic preconditioning (IP)에 의해 뇌경색 부위와 부종이 줄어듦을 확인하였으며, ischemic preconditioning 후 agmatine 의 양이 실험대조군에 비해 유의하게 증가하였고, 그 양은 약 2배 정도로 늘어났다. 또한 1시간의 심각한 허혈손상 후 재관류 손상이 시작된 지 1시간 후 역시 agmatine은 허혈손상 시작 전 보다 약 2배 이상 늘어났고 이와 같은 결과는 실험대조군과 ischemic preconditioning군 에서 동일하게 관찰되었다. Agmatine을 생성하는 알기닌탈탄소 효소(ADC) 의 발현을 조사한 결과 실험대조군과 ischemic preconditioning 군에서의 차이는 없었다. 다만 허혈손상 1시간차에 실험대조군에서 더 많이 발현된 것으로 확인되었다. 재관류시의 ADC의 발현은 실험대조군과 ischemic preconditioning 군에서 차이가 거의 없었다. 면역조직화학 결과에서 보면 ADC 의 발현은 ischemic preconditioning에 의해 보호된 부위에서는 그 발현이 실험대조군에 비해 증가함을 보여주고 반면, 손상된 부위에서는 ADC 의 발현이 별 차이가 나지 않음을 확인하였으며, 이는 ADC 에 의해 생성되는 agmatine이 연관되어 있음을 간접적으로 보여주는 것이라 생각된다. 허혈후 재관류 손상시 cell death에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 nNOS와 iNOS 발현을 조사한 결과, ischemic preconditioning으로 인해 nNOS 의 발현은 재관류 1 시간과23시간에 현격히 줄어들었으며, 반면 iNOS는 실험대조군과 마찬가지로 발현됨을 확인하였다. 따라서 Ischemic preconditioning에 의해 증가된 agmatine이 nNOS 의 발현을 감소시킴으로써 신경보호작용을 나타내었을 것으로 생각되었다.Ischemic preconditioning 시 세포생존에 밀접한 연관이 있는 것으로 알려진 ERK의 발현을 확인한 결과, 허혈 및 재관류 손상 동안 ischemic preconditioning 군에서 더 많이 발현되거나 비슷한 정도로 발현되는 것으로 관찰되었다. 특히 ischemic preconditioning으로 허혈손상 시작 전에 이미 ERK 의 발현이 증가하였으며, 이러한 ERK의 증가가 허혈 및 재관류 손상 시 세포 손상을 막아주는 역할을 하였을 것으로 판단된다. 또한 최근에 신경보호효과가 있는 것으로 보고되는 BMP-7의 발현을 조직면역염색으로 확인한 결과 재관류 1시간에 ischemic preconditioning에 의해 보호된 부위에서 그 발현이 증가하였음을 확인하였다.이상의 결과로부터 ischemic preconditioning 에 의해 agmatine의 양이 증가함으로써 내재적 신경보호 효과가 증가 되었고, 이와 같은 agmatine의 신경보호효과는 허혈손상에 대한 내성 증가와 연관성이 있을 것으로 생각되었다. 아그마틴의 농도는 ischemic preconditioning 시 증가 되었고, 이렇게 증가된 아그마틴은 허혈손상시 더 많은 양의 아그마틴을 생성하였다. 따라서 본 실험결과로부터 아그마틴은 ischemic preconditioning 과 연관되어 신경보호 효과를 갖고 있고, 이러한 결과는 향후 허혈성 뇌질환의 치료에 가능성을 갖고 있다고 할 수 있다.

[영문]Agmatine is an endogenous clonidine-displacing substance, an agonist for the α2-adrenergic and imidazoline receptors, and an antagonist at N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Agmatine was shown to protect neurons against glutamate toxicity and this effect was mediated through NMDA receptor blockade, with agmatine interacting at a site located within the NMDA channel pore. Furthermore, this protection is associated with decreased nitric oxide synthase (NOS) activity and expression, as well as NO generation.Preconditioning describes a powerful sublethal treatment, which induces neurons to become more resistant to a subsequent ischemic insult. Ischemic preconditioning is one of the most important endogenous mechanisms for protecting cells against ischemic and reperfusion injury.In this study, the association of agmatine with ischemic preconditioning and ischemic tolerance was investigated. The data obtained here have demonstrated that the endogenous neuroprotective mechanisms are facilitated by ischemic preconditioning through increasing ischemic tolerance by agmatine. The level of agmatine was increased during the ischemic preconditioning and the increased level of agmatine also facilitates the agmatine production during the ischemic injury. However, expression of arginine decarboxylase (ADC) in preconditioning group was not demonstrable during the ischemic injury and reperfusion injury.Being structurally similar to L-arginine, agmatine has been considered as a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor, especially neuronal NOS. To investigate the relationship between elevating levels of agmatine during ischemic preconditioning and NOS expression, immunostaining against NOSs was performed. Results indicated that the agmatine has a ischemic preconditioning decreased the expression of nNOS in the cerebral cortex and striatum at 1 hr and 23 hr reperfusion following 1 hr ischemia.The level of ERK which regulates various cellular processes such as cell growth and differentiation was determined in ischemic brain with or without ischemic preconditioning. The protein expression of ERK was increased in ischemic preconditioning group than the experimental control group.The expression of BMP-7 was also investigated in this study. The level of BMP-7 was induced in preconditioning group under MCA occlusion. Induced level of agmatine may act by increasing the expression of BMP-7 and ERK which are involved in cell survival.These results indicated that neuroprotective mechanism of ischemic preconditioning might be related with elevated level of agmatine and increasing BMP-7, ERK expression.