Effects of cationic liposomes on in vitro and in vivo transduction mediated by adenoviral vectors

Abstract

[한글]아데노바이러스 벡터는 유전자 발현효율이 좋아 유전자 치료에 널리 사용되고 있다. 하지만 이러한 아데노바이러스 벡터는 세포감염을 위해서 CAR (coxsackie adenovirus receptor)의 발현을 필요로 하며, 특히 체내에서는 간, 비장 등의 장기에 비특이적으로 축적되는 단점을 가지고 있다. 따라서 본 논문에서는 이러한 단점을 극복하기 위해, 다양한 조성의 양이온성 리포솜과 아데노바이러스 벡터를 결합(complexation)시켜 세포내 그리고 체내 유전자전달(transduction)양상을 확인하고자 하였다. 양이온성 리포솜은 DMKE(O, O’-dimyristyl-glutamyl- lisine), DMKE/Chol(cholesterol) (60:40 molar ratio), DMKE/Chol/Gal-Cer (galactosyl ceramide) (60:35:5, 몰비율) 세 가지로 제조되었다. 일반적으로 CAR를 발현하지 않는 B16BL6 세포와 MCF-7 세포에서는 양이온성 리포솜이 아데노바이러스 벡터의 유전자전달활성을 향상시켰다. 반면에 CAR를 발현하여 아데노바이러스에 의해 유전자전달이 비교적 잘되는 HeLa, HepG2, SNU739 세포에서는 다양한 영향을 주었다. 양이온성 리포솜이 HeLa 세포에서의 유전자전달에 거의 영향을 주지 않았거나 HepG2 세포에서는 유전자전달효율을 감소시켰던 반면에 SNU793 세포에서는 유전자전달효율을 향상시켰다. B16BL6 세포가 이식된 C57BL/6 동물 모델에 아데노바이러스 벡터만을 투여한 결과 간조직에서 가장 높은 유전자발현을 볼 수 있었다. 반면에 양이온성 리포솜을 결합한 아데노바이러스복합체를 투여한 경우에는 간에서의 유전자발현이 최고 200배의 이상의 감소하였다. 이러한 간에서 유전자발현 감소에도 불구하고 암조직을 포함한 여타 조직에서의 유전자발현은 증가되지 않았다. DMKE/Chol, DMKE/Chol/Gal-Cer 리포솜 역시 간에서의 유전자발현을 억제하였을 뿐 아니라 다른 장기에서 유전자발현 또한 감소하였다. 또한 HeLa 세포가 이식된 누드마우스에서도 아데노바이러스는 간과 비장에서 높은 유전자 발현을 유도하였다. 같이 투여된 DMKE/Chol/Gal-Cer 리포솜 역시 간과 비장에서 유전자 발현을 억제하였다. 본 연구를 통해 아데노바이러스 벡터에 양이온성 리포솜을 결합시킴으로써 대상세포의 CAR발현에 상관없이 효과적인 유전자발현을 유도할 수 있으며, 생체 내에서는 간과 비장으로의 축적을 감소시킬 수 있었다.

[영문]Adenoviral vectors have been widely used in gene therapy trials because of their efficiency in gene transfer. However, their application is limited by their requirement for cancer cells to express appropriate receptors such as coxsackie adenovirus receptor (CAR) in vitro and by non-specific viral uptake in the liver. To overcome both limits, in this study adenoviral vectors were complexed with cationic liposomes, a non-viral gene carrier non-specific to cell types and then tested in varied cancer cell lines and mice carrying tumor models. Adenoviral vectors encoding green fluorescence protein (GFP) or luciferase (Luc) were mixed with O,O'-dimyristyl-glutamyl-lisine (DMKE), DMKE/cholesterol (Chol), or DMKE/Chol/D-galactosyl-β1-1’ceramide (Gal-Cer) liposomes to form adenovirus(Ad)-liposome complexes. Cancer cell lines expressing CAR were effectively infected by adenoviral vectors without cationic liposomes, which was proved by fluorescence-activated cell sorter (FACS) analysis of GFP expression. Adenoviral transduction to CAR-deficient B16BL6 and MCF-7 cancer cells was significantly enhanced by cationic liposome complexation to adenoviral vectors. Meanwhile, the cationic liposomes variably affected in vitro adenoviral gene transduction to CAR-expressing HeLa, HepG2, and SNU739 cells. In vivo adenoviral transduction of luciferase gene was imaged by luminometer (IVISTM). In order to evaluate biodistribution of adenoviral vectors, adenovirus or Ad-DMKE liposome complexes were intravenously administered to C57BL/6 mice bearing CAR-deficient B16BL6 mouse melanoma cells. The adenovirus complexed with the DMKE liposomes exhibited 200-fold lower hepatic transduction than adenovirus alone. Meanwhile, gene expression in tumor tissues was insignificantly affected by the cationic liposomes. The DMKE/Chol and DMKE/Chol/Gal-Cer liposomes were more effective in reduction of adenoviral hepatotropism than the DMKE liposomes in the same mouse model. Adenovirus and the Ad-liposome complexes were also administered to mice carrying CAR-positive tumors. When systemically administered to BALB/c nu/nu mice carrying CAR-positive HeLa cells, Ad-vectors were readily accumulated in the mononuclear cell phagocytic system (MCPS) in the liver and spleen. However, adenovirus complexed with DMKE/Chol/Gal-Cer liposomes exhibited no transgene expression in the liver and spleen. This study suggests that the cationic liposomes complexed with Ad-vectors enhance in vitro adenoviral transduction to CAR-deficient cells as well as reduce hepatotropism of Ad-vectors.