Preservation of human saphenous vein by green tea polyphenol treatment under physiological conditions

Abstract

[한글]차 폴리페놀(polyphenol)은 카테킨(catechin)으로 알려져 있으며 녹차의 주요한 카테킨으로는 epicatechin, epicatechin-3-gallate, epigallocatechin 및 epigallocatechin -3-gallate 등이 있다. 이들 페놀성 화합물은 항산화성, 항발암성, 항돌연변이성, 항염증유발성, 항균성 및 항바이러스성 등과 같은 다양한 생체활성을 지닌 기능성 식품으로 잘 알려져 있다. 그러나, 포유동물 세포와 혈관 조직 보존에 대한 녹차 폴리페놀의 효과에 대해서는 거의 알려진 바가 없는 실정이다. 게다가, 이러한 녹차 폴리페놀의 보존 효과에 대한 기작은 알려져 있지 않다. 본 연구에서는, 녹차 폴리페놀의 세포활성정지(cytotastic) 작용을 통한 생리적 보존이 세포 주기(cycle) 조절과 연관되어 있을 가능성에 대하여 연구하였다.

본 논문의 처음 두 장에서는, 쥐 신생아 두개골-유래 골아세포(neonatal rat calvarial osteoblasts)와 사람 복재 정맥(human saphenous veins)에 대한 활성 산소종(reactive oxygen species)의 유해성 및 녹차 폴리페놀의 잠재적인 보호 효과에 대해 각각 확인하였다. 또한, 정상적인 쥐 골아세포(normal rat osteoblasts)에서 녹차 폴리페놀의 세포활성정지 효과에 대해 세포의 성장, 기능, 형태 및 DNA 세포 주기에 기초하여 각각 조사하였다. 후반부에서는, 생리적 조건에서 사람 복재 정맥의 단기 혹은 장기 보존에 있어서 녹차 폴리페놀의 가능한 효과에 대해 생화학적, 생체역학적 그리고 조직학적으로 각각 검증하였다.

먼저, 쥐 두개골-유래 골아세포에 산화적 스트레스를 유발하기 위해, 100 mM 과산화수소(H2O2)를 첨가하거나 40 U/L 크산틴 산화효소(xanthine oxidase)와 250 μM 크산틴의 효소-기질 반응을 이용하였다. 하루 동안 배양한 다음, 세포의 생존능, 기능 및 형태를 각각 조사하였다. 형광물질 이중 염색에 의한 유세포 분석 및 MTT 분석 결과, 두 가지 산화적 스트레스 유발 방법이 골아세포의 생존능을 유의하게 (p< 0.05) 감소시켰음을 확인할 수 있었다. 또한 과산화수소 첨가 후에 알칼리성 인산화 효소(alkaline phosphatase)의 활성은 유의하게 (p< 0.05) 감소되었으나, 크산틴 산화효소는 같은 효과를 나타내지 않았다. 광학 현미경 관찰 결과, 두 방법에 의한 산화적 스트레스가 형태적인 변형과 세포내 초미세구조의 손상을 현저하게 유발함이 확인되었다. 골아세포를 200 ㎍/㎖의 녹차 폴리페놀 용액에 1시간 동안 전-배양하면 과산화수소에 의해 유발된 세포의 변질이 방지될 수 있음을 알 수 있었다. 크산틴 산화효소에 의해 산화적 스트레스가 유발되었을 때에도, 같은 농도로 폴리페놀을 전처리 하면 세포의 생존능과 형태가 유지됨을 확인할 수 있었다.

사람 복재 정맥의 경우, 위와 같은 방법으로, 0.8 혹은 1.6 M 과산화수소를 첨가하거나 80 혹은 160 U

L 크산틴 산화효소와 0.5 mM 크산틴을 이용하였다. 하루 동안 배양한 다음, 혈관 조직-유래 내피세포의 생존능 및 혈관 조직을 각각 관찰하였다. 두 가지 산화적 스트레스 유발 방법에 의해, 세포 생존능의 유의한 (p< 0.05) 감소 및 혈관의 심각한 구조적 형태적 변형이 일어났음을 알 수 있었다. 과산화수소에 의해 유발된 이러한 변질이 정맥 조직을 0.5 혹은 1.0 ㎎/㎖의 녹차 폴리페놀 용액으로 1시간 동안 전-배양하면 눈에 띄게 방지됨을 알 수 있었다. 크산틴 산화효소에 의해 산화적 스트레스가 유발되었을 때에도, 같은 농도로 폴리페놀을 전처리 하면 내피세포의 생존능과 혈관 구조가 보호됨을 알 수 있었다.

녹차 폴리페놀의 차별적인 세포 반응성에 대해 정상적인 쥐 골아세포와 쥐의 골 생성 전구 세포 (pre-osteoblasts, MC3T3-E1) 및 두 가지의 사람 골육종 세포(MG-63 and Saos-2) 등을 이용하여 조사하였다. 마이크로 몰 농도(0.1, 1, 10 and 100 μM, 24시간)의 녹차 폴리페놀을 골육종 세포에 각각 처리하면 농도에 따른 세포 성장과 알칼리성 인산화 효소의 활성의 저해, 형태적인 변질, G0/G1 단계에서의 세포 주기 정지 및 그로 인한 세포사멸 유도 등의 결과를 초래하지만, 정상 골아세포에서는 이러한 현상이 일어나지 않음을 알 수 있었다. 이러한 녹차 폴리페놀 처리가 세포활성정지 기능인지 세포사멸 기능인지에 대해 확인하기 위해, 밀리 몰 농도(0.1, 0.5 and 1.0 mM, 24시간)의 녹차 폴리페놀을 배양된 정상 골아세포와 암세포(MG-63)에 각각 24 시간동안 처리하였다. 정상 골아세포에서는 단지 최고 농도(1.0 mM)의 녹차 폴리페놀 처리 시에만 약간의 세포 성장과 기능의 저해가 관찰된 반면에, MG-63 세포에서는 유의한 (p< 0.05) 저해 반응이 나타났다. 그리고, DNA 세포 주기 분석을 통해 녹차 폴리페놀 처리가, 비록 농도가 다르긴 하지만, 이들 두 세포에서 세포 주기의 G0/G1 단계에서 세포 집단의 농도에 따른 차별적으로 증가함을 확인하였다. 다시 말해, 정상 골아세포에서는 녹차 폴리페놀 처리에 의한 G0/G1 세포집단의 증가가 MG-63 세포에 비해, 훨씬 더 높은 농도에서 일어남을 알 수 있었다.

생리적 조건 하에서 사람 복재 정맥의 단기 보존 시에 녹차 폴리페놀의 잠재적인 역할을 연구하기 위해서, 혈관 조직을 1.0 ㎎/㎖의 녹차 폴리페놀 용액으로 4 시간 동안 전처리한 후에 1, 3, 5, 7, 14일 동안 37℃CO2-배양기에서 배양하거나 혹은 배양 기간 동안에 같은 농도의 폴리페놀 용액으로 계속 배양하였다. 배양한 후에, 혈관 내피세포의 생존능, 내피세포 산화 질소 합성 효소(endothelial nitric oxide synthase) 발현량 및 혈관 조직을 각각 관찰하였다. 혈관 조직에 폴리페놀을 처리하지 않았을 때에는, 내피세포의 생존능이 배양 시간에 따라 유의하게 (p< 0.05) 감소하였으며(7일 후, 약 50%), 5일이 지나면 내피세포 산화 질소 합성 효소를 거의 발현하지 못함을 알 수 있었다. 게다가, 극심한 조직학적인 변형과 구조적인 손상 또한 관찰되었다. 대조적으로, 정맥 조직에 녹차 폴리페놀을 전처리 하면 이러한 현상들이 상당히 예방됨을 알 수 있었다. 녹차 폴리페놀-처리 혈관의 내피 세포 생존능은 7일 후에도 거의 64%였으며, 산화 질소 합성 효소 발현은 신선한 혈관과 비교하였을 때, 40% 가량 유지되었다. 조직학적인 관찰 결과, 혈관 구조 역시 신선한 혈관과 상당히 유사함을 알 수 있었다. 한편, 배양 기간 동안에 폴리페놀을 계속 처리했을 때에도, 혈관 조직이 세포 생존능(61%) 뿐만 아니라 내피세포 산화 질소 합성 효소 발현량(45%)을 유지함과 동시에 형태적으로도 어떠한 변형이 없이 혈관 구조를 유지하면서 일주일 동안 생리적 조건에서 보존될 수 있었음을 확인하였다.

위에서 언급한 생리적 조건에서 사람 복재 정맥을 더욱 오랫동안 보존하기 위해서, 정맥 조직에 0.5 혹은 1.0 ㎎/㎖의 녹차 폴리페놀 용액을 하루 동안 전처리한 다음, 37℃CO2-배양기에서 1, 2, 4, 8주 동안 배양하였다. 배양한 후에, 혈관 내피세포의 생존능, 내피세포 산화 질소 합성 효소 발현량, 혈관의 생체역학적 특성 및 혈관 조직을 각각 관찰하였다. 폴리페놀을 처리하지 않고서 혈관 조직을 배양했을 경우에는, 배양 시간에 따른 내피세포의 생존능의 유의한 (p< 0.05) 감소가 유발되었으며, 심지어 일주일 후에 내피세포는 산화 질소 합성 효소를 거의 발현하지 못하였다. 또한, 폴리페놀-비처리 혈관은 파괴 강도(failure strength), 탄성 계수(elastic modulus) 및 순응도(compliance)와 같은 기계적 특성에 있어서 상대적으로 열악함을 나타내었다. 이러한 결과는, 심각한 구조적인 변형을 보이고 있는, 조직학적인 관찰에 의해 확증되었다. 이와는 대조적으로, 혈관 조직을 1.0 ㎎/㎖의 녹차 폴리페놀 용액으로 전처리 하면 이러한 현상들을 현저하게 막을 수 있었다. 녹차 폴리페놀-전처리 혈관의 경우, 내피 세포 생존능과 내피세포 산화 질소 합성 효소 발현량, 생체역학적 특성 및 형태적 변형 없는 혈관 구조를 유지하면서 적어도 2주일 동안 생리적 조건에서 보존될 수 있었음을 확인하였다.

결론적으로, 이러한 결과를 통해 녹차 폴리페놀이 생물학적 항산화제로서 작용하여 산화적 스트레스-유발 독성으로부터 포유동물 세포와 조직을 보호할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 세포활성정지 보존제로서 폴리페놀의 사용으로 정상 세포의 대사작용을 조절하고 생리적 온도 조건에서 혈관을 더 오래 동안 보존하는 것이 가능함을 알 수 있다. 이러한 사실을 토대로, 녹차 폴리페놀 처리가 생리적 조건에서 사람 복재 정맥을 보존하는데 있어서 유용한 방법이 될 수 있다는 것을 제시하고자 한다.

[영문]Tea polyphenols are known as catechins and the main catechins in green tea are epicatechin, epicatechin-3-gallate, epigallocatechin and epigallocatechin -3-gallate. These phenolic compounds are well known as a functional food with various bioactivities, such as antioxidative, anticarcinogenic, antimutagenic, antiinflammatory, antimicrobial and antiviral activities. However, less attention has been paid to the effects of green tea polyphenols (GTPs) on the preservation of mammalian cells and blood vessels. Furthermore, the mechanism of this preservation effect of the GTP is not known. In this study, it was investigated that this physiological preservation through the cytostatic activity of the GTP might be involved in cell cycle control.

In the first parts of this thesis, the injurious effects of reactive oxygen species (ROS) on neonatal rat calvarial osteoblasts (NRCOs) and human saphenous veins (HSVs) and the potential protective roles played by the GTPs were respectively investigated. Additionally, the cytostatic effects of the GTP on normal rat osteoblasts (NROs) were examined on the basis of cell growth, function, morphology and DNA cell cycle assay. In the last part, the potential effects of the GTP on the short- and long-term preservation of the HSV under physiological conditions was investigated biochemically, biomechanically and histologically.

Oxidative stress was induced in the NRCOs, either by adding 100 mM H2O2 or by the action of 40 U/L xanthine oxidase (XO) in the presence of xanthine (250 μM). After incubation, the cellular viability, function and morphology were evaluated. Both treatments produced a significant (p < 0.05) reduction in osteoblast viability, as assessed by a two-colored fluorescence staining method combined with cellular cytometric analysis and MTT assay. A significant (p < 0.05) reduction in the alkaline phosphatase activity was also observed after H2O2 addition, whereas XO did not have the same effect. On the microscopic observations, the morphological changes and intracellular ultrastructural damages were remarkably induced by both treatments. The H2O2-induced alterations were prevented by pre-incubating the osteoblasts with 200 ㎍/㎖ GTP for 1 h. When the oxidative stress was induced by XO, the cellular viability and morphology was also maintained at the same GTP concentration.

In the cases of the HSV segments, oxidative stress was also induced exogenously either by adding 0.8 or 1.6 M H2O2, or by using 80 or 160 U/L XO in the presence of xanthine (0.5 mM). After incubation, the viability of the endothelial cells (ECs) dissociated from the veins and the venous histology were respectively evaluated. Due to both treatments, a significant (p < 0.05) decrease in the cellular viability and severe structural and morphological changes in the veins were induced. The H2O2-induced alterations were markedly prevented by pre-incubating the veins with either 0.5 or 1.0 ㎎/㎖ GTP for 1 h. When the oxidative stress was induced by XO, the cellular viability and the vascular structure were also preserved at the same GTP concentration.

The differential cellular responses to the GTP was examined in osteoblastic cells such as NROs, mouse pre-osteoblasts (MC3T3-E1) and human osteocarcinoma (MG-63 and Saos-2) cells. The GTP treatment with micromolar concentrations (0.1, 1, 10 and 100 μM for 24 h) resulted in dose-dependent inhibitions of cell growth and ALP activity, morphological alterations, G0/G1-phase arrest of the cell cycle and induction of apoptosis in both osteocarcinoma cells, but not in the NROs. In order to investigate whether the GTP treatment was cytostatic or apoptotic, the millimolar concentrations (0.1, 0.5 and 1.0 mM) of the GTP were treated to the growing normal (NROs) and cancer cells (MG-63) for 24 h. The GTP treatment slightly inhibited the growth and function of NROs only at the highest concentration (1.0 mM), while it imparted significant (p < 0.05) inhibitory responses in the MG-63 cells. In addition, DNA cell cycle assay revealed that the GTP treatment resulted in dose-based differential increases of cell population in the G0/G1-phase of the cell cycle in both NROs and MG-63 cells, albeit at different concentrations. The GTP-mediated increase of the G0/G1 cell populations was found to occur at much higher dose of the GTP in the NROs, as compared to the MG-63 cells. These results suggest that the induction of cytostatic stage may be mediated through the regulation of cell cycle.

In order to investigate the potential role of the GTP in the short-term preservation of the HSV under physiological conditions, the vein segments were incubated for 1, 3, 5, 7 and 14 days at 37℃ in a CO2-incubator, either after 4 h of treatment with 1.0 ㎎/㎖ GTP (pretreatment) or in the presence of the GTP at the same concentration (co-treatment). After incubation, the EC viability, endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expression level and the vascular histology were evaluated, respectively. When the veins were not treated with the GTPs, the viability of the ECs was significantly (p < 0.05) reduced with the progress in the culture time (about 50% after 7 d), and none of the cells expressed eNOS after 5 d. Furthermore, severe histological changes and structural damage were observed in the non-treated veins. In contrast, the pretreatment of the veins with the GTPs substantially prevented these phenomena. The cellular viability of the GTP-treated vein was approximately 64% after 7 d, and eNOS expression was maintained up to 40%, compared to that of the fresh vein. The histological observations showed that the vasculature was quite similar to that of the fresh vein. When co-treated with the GTPs, the vein could be also preserved for 1 wk under physiological conditions, retaining the eNOS expression level (45%) as well as the cellular viability (61%) and maintaining vascular structures without any morphological changes.

For longer term preservation of the HSV under physiological conditions, the HSV segments were pretreated with 0.5 or 1.0 ㎎/㎖ GTP for 1 d and then incubated for 1, 2, 4 and 8 wk at 37℃ in a CO2-incubator. After incubation, the cellular viability, the eNOS expression level, the biomechanical properties and the vein histology were respectively evaluated. When the HSV segments were incubated without the GTP treatment, a significant (p < 0.05) time-dependant EC viability reduction was occurred, and the ECs was unable to express eNOS even after 1 wk. In addition, the non-treated veins demonstrated relatively inferiority in such the mechanical properties as the failure strength, the elastic modulus and the compliance, to those of the fresh veins. These results were confirmed by the histological observations, which demonstrated severe structural changes in the non-treated veins. On the contrary, these phenomena were noticeably prevented by pre-incubating the veins with 1.0 ㎎/㎖ GTP under physiological conditions for 1 d. The GTP-pretreated vein could be preserved for at least 2 wk under physiological conditions, retaining both cellular viability and eNOS expression level and maintaining biomechanical properties and venous structures without any histological aberrations.

In conclusion, these results demonstrate that the GTP is able to act as a biological antioxidant and protect mammalian cells and veins from oxidative stress-induced toxicity. Also, the use of polyphenol as the cytostatic preservation agent can control the cellular metabolism of normal cells and facilitate the longer term preservation of blood vessels at a physiological temperature. On the basis of these results, it may be suggested that a GTP treatment can be a useful method for preserving the HSV under physiological conditions.