매독균에 대한 단세포군 항체의 생산및 특성에 관한 연구

Abstract

[영문]

[한글]

Treponemes에는 매독, yaws, pinta를 유발하는 병원성 treponemes와 인체의 성기, 구강

, 소화기 점막 등에 정상으로 존재하는 비병원성 treponemes가 있다. 비병원성 treponeme

s는 배지에 배양되나 많은 시도에도 불구하고 매독의 원인균인 Treponema pallidum은 아

직 인공배지에서 배양이 되지 않아 실험동물에 접종함으로써 제한된 양을 얻을 수 밖에

없다. 그러므로 매독의 병인론, 면역학적 진단, 면역학적인 예방에 대한 연구에도 많은

제한을 받아 이러한 연구를 위하여 재조합 DNA 기술(recombinant DNA technique)을 이용

한 항원의 합성과, 항원분석 및 매독진단에 이용할 수 있는 매독균 측이 단세포군 항체에

대한 연구가 이루어지고 있다. 이에 본 실험에서 T. pallidum의 단세포군 항체를 만들어

이의 특성을 관찰하고 매독 진단에 이용 가능성을 평가하고자 본 실험을 착수하였다.

본 연구자는 림프구 세포 융합법을 이용하여 T. pallidum에 대한 특이 단세포군 항체를

생산하여 각각의 isotype을 알아보고 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)로 T. p

allidum에 대한 반응도를 보았으며 T. phagedenis, T. denticola, T. vincentii, Leptosp

ira interrogans serovar lai, Borrelia burgdorferi 및 정상 토끼 고환 조직과의 교차

반응을 관찰하였다. 그리고 생산된 단세포군 항체의 역가를 간접 면역 형광 검사와 적혈

구 응집 반응으로 관찰하였으며 매독균의 어떤 항원과 반응하는 지를 보고자 sodium dode

cyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) 및 immunoblotting을 시행하

였다. 생산한 단세포군 항체의 임상적 응용 가능성을 관찰하기 위하여 토끼의 항매독균

혈청 및 매독 환자 혈청과 반응시킨 ELISA-inhibition 검사를 시행하였고 도말 포본에서

T. pallidum, T. phagedenis, T. denticola,T. T. vincentii, L. interrogarns B. burgdo

rferi를 항원으로 이용, 생산된 단세포군 항체와의 반응을 간접 면역 과산화 효소법으로

관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. T. pallidum으로 면역시킨 마우스의 비장세포와 골수종 세포를 융합하여 T. pallidu

m과 반응하는 항체를 분비하는 7주의 단세포군(YS 3, YS 75, YS 307, YS 481, YS 343, YS

1. YS 406)을 얻을 수 있었다.

2. 항체의 isotype으로 3주의 단세포군(YS 75, 343, 406) 항체는 IgGl, 3주의 단세포군

(YS 3,307,481) 항체는 IgG2a이었으며 1주의 단세포군(YS 1) 항체는 IgG2b이었다.

3. ELISA에서 T. pallidum에 대한 7주의 단세포군 항체의 흡광도는 0.59부터 1.48까지

였으며 이 중 5주의 단세포군(YS 3, 75, 307, 481, 406) 항체는 매독균을 항원으로 사용

한 간접 면역 형광 검사에서 비교적 강한 형광을 발현하였고 적혈구 응집 능력이 있었으

나 2주의 단세포군(YS 343, 1) 항체는 형광발현도 미약하였고 적혈구도 응집하지 못하였

다.

4. 7주의 단세포군에서 분비된 항체가 T. pallidum이외의 다른 종류의 treponemes, L.i

nterrogans, B. burgdorferi 및 정상 토끼 고환 조직과 교차 반응하는지 알기 위하여 ELI

SA를시행한 바 6주의 단세포군(YS 3, 75, 307, 481, 1, 406)에서 분비된 항체는 모두 비

교 균주 및 정상 토끼 고환 조직과 교차 반응하지 않았으나 YS 343에서 분비된 항체는 T.

pallidum 이외에 T. phagedenis, T denticola, T. vincentii라 교차 반응하였다.

5. SDS-PAGE및 immunoblotting에서 5주의 단세포군(YS 75, 307, 481, 1, 406) 항체는

분자량 47 kDa의 매독균 단백 항원과 반응하였으며 YS 343에서 분비된 항체는 T. phagede

nis와의 교차 반응 항원인 분자량 64kDa의 단백 항원과 반응하였고 YS 3에서 분비된 항체

는 반응을 보이지 않았다.

6. 단세포군 항체를 이용한 임상 응용의 간접 검증을 위한 ELISA-inhibition 검사에서

토끼의 항매독균 혈청이 희석됨에 따라 단세포군(YS 3 및 YS 307) 항체의 반응 억제율이

감소되었다. 각 임상기의 매독환자 혈청과 단세포군(YS 307, 481) 항체를 섞어 ELISA-inh

ibition 검사를 시행한 결과 모든 임상기의 매독 환자 혈청에서 억제 반응을 나타냈으며

단세포군(YS 307 및 YS 481) 항체의 평균 억제율은 각 입상기에 따라 1기 매독에서 32.9%

및 19.5%, 2기매독에서 67.2% 및 40.2%, 조기잠복 매독에서 78.8% 및 39.1%, 만기잠복

매독에서 34.2% 및 6.7%이었고 각 임살기의 혈청과 정상인의 혈청사이에 통계학적으로 유

의한 차이가 있었다(p<0.05).

7. 도말 표본에 시행한 간접 면역 과산화 효소 염색에서 6주의 단세포군 항체는 강하게

, 1주는 약하게 T. pallidum과 반응하였다. 6주의 단세포군 항체는 다른 비교 균주와 반

응하지 않은 반면, YS 343에서 분비한 항체는 비병원성 treponemes와 반응하였으나 L. in

terrogans, B. burgdorferi와는 반응하지 않았다.

이상의 결과로 븐 연구자가 생산한 매독균에 대한 단세포군 항체는 주로 매독균의 주항

원인 분자량 47 kDa와 반응하였으며 매독균에 대해 특이성을 나타내었고 항매독균 항체

역가가 비교적 높아 향후 매독의 진단에 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

Production and Characterization of Monoclonal Antibodies to Treponema pattidum

Kyu Kwang Whang

Department of Medical Science The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Professor Jung Bock Lee, M.D.)

Treponema pallidum, T. pertenue and T. carateum inducing syphilis, yaws and pinta

respectively, are included among pathogenic treponemes; and T. denticola, T.

microdentium, T. phogedenis and T. vincentii, which reside normally in oral,

genital and gastroenteric mucosa, are included among nonpathogenic treponemes.

Nonpathogens can be cultured in broth thioglycollate media, but T. pallidum can

only be cultured by inoculation into rabbit testicle, so relatively small amounts

can be obtained. For this reason, there are many restrictions in pathogenetic,

immunodiagnostic and preventive studies.

Recently, researchers have succeeded in producing recombinant DNA clones

expressing T. pallidum genes encoding for treponemal immunogens and monoclonal

antibodies for their screenings. This study was attempted to produce the monoclonal

antibodies specific for T. pallidum and to investigate their characteristics,

thereby contributing to identify the antigenic structure and aid in the diagnosis

of syphilis.

The author produced monoclonal antibodies against T. pallidum using hybridoma

technology, measured optical densities or antibody titers by enzyme-linked

immunosorbent assay(ELISA), indirect immunofluorescence or hemagglutination

technique, investigated their isotypes using an isotyping kit and cross

reactivities with T. phngedenis, T. denticola, T vincentii, Leptospira interrogans

serovar lai, Borrelia burgdorferi and normal rabbit testicular tissue, and

determined the molecular characteristics of protein antigens which reached with

monoclonal antibodies. ELISA-inhibition tests and indirect immunoperoxidase

staining with these monoclonal antibodies were also performed.

The results are as follows:

1. The seven clones (YS 3, YS 75, YS 307, YS 481, YS 343, YS 1 and YS 406)

secreting monoclonal antibodies reactive with T. pallidum were produced by fusing

T. pallidum immunized mouse spleen cells and myeloma cells.

2. The isotypes of the 7 monoclonal antibodies produced were IgGl(YS 75, 343,

406), IgG2a(YS 3, 307, 481) and IgG2b(YS 1).

3. Optical densities of the 7 monoclonal antibodies were ranged from 0.59 to 1.48

as measured by ELISA. Monoclonal antibodies from five (YS 3, 75, 377, 481, 406) of

the 7 clones could agglutinate sheep RBC sensitized with T. pallidum and showed

strong fluorescences, but monoclonal antibodies from two (YS 343, 1) clones could

not agglutinate and showed very weak fluorescences.

4. The monoclonal antibody from YS 343 was cross-reactive with nonpathogenic

treponemes(T. phagedenis, T. denticola, T vincentii) but was not cross-reactive

with L. interrogans, B. burgdorferi and normal rabbit testicular tissue by the

ELISA method. The other 6 monoclonal antibodies reacted with T. pallidum

specifically.

5. On immunoblotting, monoclonal antibodies from five (YS, 75, 307, 481, 1, 476)

of the 7 clones reacted with a polypeptide of a molecular weight of 47 kDa and

monoclonal antibodies from YS 343 reacted with a polypeptide of 64 kDa common to

both T. pallidum and T. phagedenis.

6. Inhibition percentages of monoclonal antibodies from YS 307 and YS 3 by

ELISA-inhibition test decreased according to serial dilutons of polyclonal rabbit

antiserum to T. pallidum. Mean percentages of inhibitions using moncolonal

antibodies from YS 307 or 481 were 32.9% or 19.5% in primary, 67.2% or 40.2% in

secondary, 78.8% or 39.1% in early latent, and 34.2% or 6.7% in late latent

spyhilis, and there was a statistically significant difference in the degree of

inhibition between groups of healthy controls and of each stage of syphilis.

7. All the 7 moncolonal antibodies could visualize brown T. pallidum by light

microscopy after indirect immunoperoxidase staining, of which the intensities of

stainings were strong in six and weak in one. Monoclonal antibody from YS 343 could

also visualize nonpathogenic treponemes but not L. interrogans and B. burgdorferi.

The other 6 were reactive only with T. pallidum.

The above results revealed the seven clones secreting monoclonal antibodies

reactive to T. pallidum were produced successfully and specific antibodies reacting

with major antigenic polypeptides of a molecular weight of 47 kDa would be useful

in the diagnosis of syphilis in the future.