2,4-dinitrophenol이 심근에서 Ca++ induced Ca++ release에 미치는 영향

Abstract

[영문]

[한글]

골격근의 흥분과 수축 사이의 연결과정 (excitation-contraction coupling)에서 여러

학자들은 Ca**++ 이 근육내의 sarcoplasmic reticulum(SR)에 저장되어 있다가 근육이 흥

분될때 이 흥분파가 T-tubule을 통하여 SR에 전달되면 이곳에 저장되었던 Ca**++ 이 유리

되어 수축요소(contractile element) 근처의 유리 Ca**++ 농도를 증가시켜 근육이 수축되

는 것임을 밝혀냈다(Ebashi 및 Lipmann, 1962; Weber등. 1964; Sandow, 1965; Winegrad,

1965; Constantin 및 Podolsky, 1967; Constantin, 1970).

포유류의 심근에서 수축빈도의 변동, 또는 약물투여등 어떤 수단을 쓰든지 근육의 수축

력을 증가시킬 때는 Ca**++ 이 plasma membrane을 통하여 세포 외부에서 내부로 많이 이

동되는 것으로 판명되었다(Winegrad 및 Shanes, 1962: Grossman 및 Furchgott, 1964a; Gr

ossman 및 Furchgott, 1964b; Grossman 및 Furchgott, 1964 c; Bailey 및 Dresel, 1968;

Langer, 1971).

Subthreshold concentration의 Ca**++ 을 주면 Ca**++ 이 축적된 SR로부터 많은 양의 C

a**++ 이 유리되는 현상 즉 Ca**++ induced Ca**++ release로 인하여 plasma membrane을

통한 Ca**++ 이 동량의 작은 변동이 Ca**++ 저장부위에서 유리되는 Ca**++ 양의 큰 변동

으로 확대될 수도 있다. 즉 이 Ca**++ induced Ca**++ release는 일종의 physiological a

mplifier로 작용할 수 있는 것이다.

SR에서 Ca**++ 이 유리되는 기전에는 여러 가지가 있지만 그중 한가지는 SR막의 depola

rization으로 되어 있다(Constantin 및 Podolsky, 1967; Endo 및 Kitazawa, 1978).

심장에서 근육수축요소의 Ca**++ 활성화에서 완전히 규명되지 않은 중요한 인자중의 하

나는 어떻게 해서 sarcolemma와 T-tubule의 depolarization이 SR로부터 Ca**++ 을 유리시

키느냐 하는 기전이다.

한편 분리된 SR에서는 SR막 내부와 외부사이에 0.2unit정도의 pH gradient가 있다고 보

고되어 있는 바(Shoshan등, 1981)이 proton gradient를 인공적으로 변화시켜 protonophor

e를 작용시킬 때는 SR막을 통하여 depolarization 또는 hyperpolarization을 일으킬 수

있을 것으로 생각되어 본 연구에서는 SR로부터 Ca**++ 이 유리되는 기전을 좀더 자세히

밝히기 위해 SR내외의 proton gradient를 강화시키거나 그 gradient를 역전시켜 2,4-dini

trophenol(2,4-DNP)을 사용하여 이 proton gradient를 없애줄 때 즉 depolarization 또는

hyperpolarization이 될때 Ca**++ induced Ca**++ release가 어떻게 변하는가를 관찰하

여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. pH 6.8에서 2,4-DNP의 농도를 1μM로 해준 경우는 대조군에 비해서 Ca**++ induced

Ca**++ release에 차이가 없지만 2,4-DNP의 농도를 5, 10 및 20μM의 농도로 만들어주면

대조군에 비해서 Ca**++ induced Ca**++ release가 의의있게(P<0.05) 증가하였다.

2. Test solution에 2,4-DNP를 10μM의 농도가 되도록 해준 경우 pH 7.0, 7.2 및 7.4에

서는 대조군과 실험군간에 Ca**++ induced Ca**++ release에 유의한 차이가 없었다. 높은

pH범위 (7.2 또는 7.4)에서 SR막은 2,4-DNP에 의해서 depolarization될 것으로 추정된다

. pH 6.6과 6.8에서는 대조군에 비해 2,4-DNP를 첨가한 군에서 Ca**++ induced Ca**++ re

lease가 의의있게 (P<0.05) 증가하였다. 이 pH범위(6.6과 6.8)에서 SR막은 2,4-DNP에 의

해서 hyparpolarization될 것으고 추정된다. 그러나 양 군에서 pH 7.0, 7.2 및 7.4에서

유리된 Ca**++ 양은 pH 6.6 및 6.8에서 유리된 양 보다 공히 많았다(P<0.05).

3. pH 6.8에서 다른 종류의 protonophore인 carbonyl cyanide p-trifluoromethoxypheny

l-hydrazone(CCCP)을 6.7μM의 농도가 되도록 해준 경우 대조군에 비해 Ca**++ induced C

a**++ release가 의의있게 (P<0.05) 증가하였다.

이상의 결과로 보아서 protonophore인 2,4-DNP 또는 CCCP는 기계적으로 plasma membran

e을 제거한 쥐의 심근 섬유에서 SR로부터 Ca**++ induced Ca**++ release를 증가시켰으며

이러한 작용은 protonophore를 첨가함으로써 생길 수 있는 SR막 전압의 변화에 관계가

없었다.

Effects of 2,4-Dinitrophenol on the Ca**++ Induced Ca**++ Release in the Heart

Muscle

Joo Yun Cho

Department of Medical Science The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Professor Doo Hee Kang, M.D., Ph.D.)

In the excitation-contraction coupling process, it has been firmly established

that Ca**++ stored in the sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cell is released

when the muscle is stimulated. The excitation is transmitted to the SR through the

T-tubule resulting in muscle contraction due to increased concentration of free

Ca**++ around the contractile element (Ebashi and Lipmann, 1962; Weber et al.,

1964; Sandow, 1965; Winegrad, 1965; Constantin and Podolsky, 1967; Constantin,

1970).

In the mammalian heart muscle it is known that when the contractility is

increased by any means, for example a change of stimulation frequency, or a drug,

the Ca**++ influx across the plasma membrane is always increased(Winegrad and

Shanes, 1962; Grossman and Furchgott, 1964 a; Grossman and Furchgott, 1964b;

Grossman and Furchgott, 1964 c; Bailey and Dresel, 1968; Langer, 1971).

However, the increased amount of Ca**++ influx in this case is still far less

than that needed to activate the actomyosin system of the cardiac tissue, so an

additional amount of Ca**++ has to be mobilized from the Ca**++ store inside the

cell. One of the possible mechanism involved here is a Ca**++ induced Ca**++

release, i,e., subthreshold concentration of Ca**++ can release a substantial

amount of Ca**++ from Ca**++ stored in the SR. A small change in Ca**++ movement

across the plasma membrane is able to increase free Ca**++ concentration through

the additional Ca**++ mobilization. In other words, this Ca**++ induced Ca**++

release mechanism behaves like a physiological amplifier.

It has been reported that there are several ways to release Ca**++ from SR, i.e.,

1) Ca**++ induced Ca**++ release 2) drug induced Ca**++ release 3) depolarization

induced Ca**++ release 4) osmotically induced Ca**++ release etc. (Ebashi, 1976)

In this study the change of Ca**++ induced Ca**++ release was investigated when

the proton gradient across the SR membrane was dissipated by

2,4-dinitrophenol(2,4-DNP) after the gradient across the SR membrane had been

increased, decreased or reversed. It was assumed that the addition of 2,4-DNP

induced hyperpolarization or depolarization across the SR membrane depending on the

proton gradient being imposed upon. The effects of those membrane potential changes

on Ca**++ induced Ca**++ release were studied.

The results are summerized as follows.

1. At pH 6.8 there was no significant change in Ca**++ induced Ca**++ release at

1μM 2,4-DNP. But there were significant(p<0.05) increase in Ca**++ induced Ca**++

release at 5, 10, and 20 μM 2,4-DNP.

2. At a concentration of 10 μM 2,4-DNP there was no significant change in the

Ca**++ induced Ca**++ release between the control and experimental groups at pH

7.0, 7.2 and 7.4. At a higher pH range(7.2 or 7.4) the SR membrane might have been

depolarized by 2,4-DNP. However there were significant (p<0.05) increase in the

Ca**++ induced Ca**++ release between the control and experimental groups at pH 6.8

and 6.6. At this pH range(6.6 and 6.8) SR membrane might have been hyperpolarized

by 2,4-DNP, Both the control and experimental groups showed an increase in the

Ca**++ induced Ca**++ release at higher pHs(7.0, 7.2 and 7.4) than at lower pHs(6.6

and 6.8)(p<0.05).

3. At pH 6.8 there was a significant(p<0.05) increase in Ca**++ induced Ca**++

release when the test solution contained 6.7μM of another protonophore, cartonyl

cyanide ptrifluoromethoxyphenyl hydrazone (CCCP).

The above results show that a protonophore, 2,4-DNP or CCCP, enhances Ca**++

induced Ca**++ release from the SR of mechanically skinned rat cardiac muscle

fiber. This effect is independent of changes in SR membrane potential which may

have occurred by the addition of protonophores.