자유생활아메바의 병원성 검정에 관한 실험적 연구

Abstract

[영문]

[한글]

자연계에 존재하는 자유생활아메바의 병원성은 주(株), 배양조건, 숙주의 연령이나 면

역상태에 따라 다르다(Wong등, 1975). 병원성 유무의 구별을 위하여 실험동물에 의한 감

염력 (Culbertson등, 1966: Kasprzak 및 Mazur, 1972; Martinez등, 1973; Wong등, 1975;

Cursons등, 1977) 판정 및 여러 방법들이 사용되어 왔지만 동물세포의 조직배양이 가능해

짐에 따라 조직배양세포에 직접 작용하는 본 원충의 생물학적 성상이나 병원성을 관찰할

수 있게 되었다(Brown, 1979; Marciano-Cabral등, 1982: Fulford등, 1985: Cline등, 1986

). 그러나 자유생활아메바의 병원성에 대한 실험적 판정기준에 모호한 점이 많고 지금까

지는 동물접종실험에 의존하여 온 실정이다.

이에 본 연구에서는 자유생활아메바중 동물접종실험에서 비병원성으로 알려진 Naegleri

a gruberi를 대조로 하여 병원성이 강한 Naegleria fowleri와 Acanthamoeba culbertsoni

의 병원성을 동물실험 이외의 방법으로 알아보고자 한 것이다. 즉, 병원성 판정에 유의하

게 쓸수 있는 동물세포를 선정하고 그 동물세포에 대한 자유생활아메바의 작용양상을 위

상차 현미경 관찰 및 trepan blue dye-exclusion test에 의한 세포의 생사판정, 방사성

동위원소인 (51)**Cr 의 유출측정 및 전자현미경적 관찰 등으로 빠른시간내에 병원성을

검정할 수 있는 방법과 기준을 마련코자 본 실험을 하였다.

사용된 조직배양세포는 CHO 세포 (Chinese hamster ovary cell)가 Vero세포 (African g

reen monkey kidney cell)나 HaLa세포(human cervical carcinoma cell)보다 적합함을 알

았고 아메바 대 동물세포의 비가 1:1 이나 1:5에서 보다 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 위

상차 현미경에 의한 관찰에서 대조군인 N. gruberi에 비해 A. culbertsoni와 N. fowleri

를 처리하였을 때 24시간 후부터 병원성의 뚜렷한 차이를 관찰할 수 있었다.

조직배양세포에 아메바를 처리하고 살아있는 세포의 수를 trypan blue로 염색하여 시간

별로 산정하여 본 바 아메바 대 CHO cell의 수의 비를 1:5로 하여 처리한 실험군에서 병

원성과 비병원성 아메바가 12시간 후부터 세포 사멸에서 차이를 보이기 시작하였고 24시

간 경과후 20%이상의 세포가 사멸되었을 경우 병원성으로 규정할 수 있었다.

좀 더 빠른 시간내에 병원성을 확인하고저 할 때는 표적세포로부터 유출되는 (51)**Cr

방사능을 측정하는 것이 타당하였으며 아메바대 CHO cell수의 비를 1:5로 하였을 때 배양

6시간 경과후 가장 좋은 결과를 얻었으며 이 때 20% 이상의 방사능이 유출되었을 경우

병원성으로 판정할 수 있었다. 아메바 추출액을 시료로 사용하였을 경우에도 chromium유

출에 현저한 차이를 보여 병원성 아메바에는 세포독성 물질이 함유되어 있음을 알 수 있

었다.

조직배양세포와 아메바사이의 생물학적 상호작용을 알아보기 위한 주사 전자현미경적

관찰에서는 조직배양세포에 병원성 아메바가 2시간만이면 접촉하는 것을 알 수 있었으며

접촉 후 조직배양세포의 손상현상을 관찰할 수 있었다.

이상의 결과로 보아 조직배양세포를 이용하여 실험실내에서 자유생활아메바의 병원성을

판정할 경우 trypan blue dye-exclusion test와 (51)**Cr 방사능 측정방법이 보다 효율

적임을 본 연구에서 입증할 수 있었고 자연계에 존재하는 여러 가지 자유생활아메바의 병

원성을 검증할 수 있는 기준을 마련할 수 있었다.

An Experimental Study on the Cytotoxicity of Free-living Amoebae

Young-Woo Lee

Department of Medical Science The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Prof. Keun-Tae Lee, M.D. and Assoc. Prof. Pyung-Rim Chung, Ph.D.)

The in vitro cytopathic effects of pathogenic and non-pathogenic free-living

amoebae on the monolayer cell lines were examined in order to establish the

standards for the early determination of pathogenic and non-pathogenic strains of

free-living amoebae.

The pathogenic strains of Naegleria fowleri and Acanthamoeba culbertsoni, and N.

gruberi, a non-pathogenic strain, were employed in this study and those strains

were cultivated with Chinese hamster ovary cells(CHO cell), African green monkey

kidney cells(Vero cell), and human cervical carcinoma cells (HeLa cell).

The results obtained in this study are as follows:

1. The CHO cell line was more suitable for assaying the cytopathic effects of

free-living amoebae than Vero and HeLa cell lines.

2. The suitable numerical ratios of amoeba to target cell for assaying the

cytopathic effects were 1:1 or 1:5.

3. In counts of live target cells by means of trypan blue dye-exclusion test, the

numerical differences between the culture systems treated with pathogenic and

non-pathogenic free living amoeba strains were observed remarkably 24 hours after

cultivation. The criterion distinguishing pathogenic strains of free-living amoebae

could be when the target cells show more than 20% of their mortalities.

4. In measurement of (51)**Cr release from the (51)**Cr-labeled target cells, the

significant differences between the culture systems treated with pathogenic and

non-pathogenic amoeba strains were observed 6 hours after cultivation, and the

amoeba strains showing more than 20% of specific release values could be regarded

as pathogenic. On the other hand, the lysates of pathogenic amoebae also showed

cytopathic effects against the target cell monolayers.

5. Scanning electron-microscopic observations (SEM) on pathogenic amoebae

cultivated together with CHO target cells were carried out to know biological

coactions between amoebae and target cells. It was known in SEM that amoebae were

setting on the target cells within 2 hours after initiating cultivation, and that

biological process damaging the target cells were proved throughout the period of

observation.

In summarizing the results, the in vitro standards differentiating the

pathogenicity of free-living amoeba in the culture systems with CHO cell line are

established by means of trypan blue dye-exclusion test and (51)**Cr release

measurements.