아드레날린성 B-수용체 자극에 의한 림프구 단백의 인산화

Abstract

[영문]

[한글]

단백의 가역적인 인산화과정이 세포의 생리적 최종반응을 매개하거나 수행한다고 알려

져 있다. 글라이코젠의 해당반응 등의 탄수화물대사, 세포증식반응, 세포막에서의 이온운

반 등의 생체반응 뿐 아니라 면역반응계에서도 특정단백의 인산화가 조절을 한다고 한다.

각종 조직에서 β아드레날린성 효과의 약리적 특성은 잘 알려져 있으며 특히 림프구에

서 β수용체에 의하여 면역 및 생체의 항상성 유지가 조절된다고 한다. β 아드레날린성

수용체가 자극되면 GTP 결합단백을 통하여 adenylate cyclase 활성으로 cAMP가 생성되고,

cAMP는 cAMP 의존성 kinase (A-kinase)를 활성화시킨다. 활성화된 A-kinase는 단백을 인

산화 시킴으로써 인산화단백이 최종적으로 반응조절에 관여한다고 한다. 그러나 림프구에

서 어느 특정단백이 A-kinase에 의해 활성화되어 반응을 매개하는지에 대한 체계적인 연

구는 되어있지 않다.

따라서 이번 연구에서는 흰쥐의 림프구에서 β아드레날린성 수용체흥분후에 나타나는

단백 인산화 양상을 관찰하고, 중간과정을 점검하여 β수용체자극후에 A-kinase에 의하여

인산화되는 특이 기질단백을 찾고자 하였다.

실험 재료로는 흰쥐(Sprague-Dawley)의 동맥혈의 림프구를 이용하였고, β수용체흥분후

반응의 출현까지의 중간단계를 추구하기 위하여 isoproterenol, propranolol, forskolin

, cAMP 및 H-8을 사용하였다.

분리된 림프구를 [(32)**P ] orthophosphate로 표지시킨 후 림프구를 균질화한 후 원심

분리하여 단백분획을 얻고, 이를 NEPHGE와 SDS-PAGE를 이용한 이차원전기영동법을 이용하

여 단백을 분리한 후 건조시킨 gel을 자가방사기록법으로 인산화단백을 관찰하였다. 한편

림프구를 미리 균질화시켜 만든 각 세포분회에서도 약물처리후 [γ-(32)**P ]ATP로 인산

화시킨 후 동일한 방법으로 인산화 단백을 관찰함으로써 앞에서 얻어진 인산화단백이 세

포의 어느 분획에 위치하는가를 확인하였다.

실험결과는 다음과 같다.

1. Isoproterenol (10**-5 M)은 흰쥐 림프구외 여러 단백을 인산화 하였으며, 그중 분

자량 44kD 등전위점 6.3(44kD/6.3) 단백의 인산화가 나타났다.

2. 림프구의 44kD/6.3 단백의 인산화는 propranolol 10**-5 M 전처치에 의하여 억제되

었다.

3. 44kD/6.3단백은 forskolin에 의하여 농도의존적으로 인산화정도가 증가하였다.

4. 림프구 균질액의 세포막 분획에 cAMP를 첨가하였을 때 44kD/6.3 단백의 인산화가 유

발되었다.

5. 44kD/6.3 단백의 인산화는 A-kinase 억제재인 H-8에 의하여 인산화가 억제되었다.

6. 44kD/6.3 단백은 세포막 분획에서는 관찰되었으나, 세포질분획에서는 관찰되지 않았

다.

이상의 실험결과로 보아 흰쥐 림프구 단백중 분자량 44kD, 등전위점 6.3의 단백은 β수

용체 자극, adenylate cyclase 활성화, cAMP 생성 및 A-kinase 활성화에 의하여 인산화되

는 단백임을 알 수 있었으며. 이 단백의 인산화가 β수용체자극에 의한 림프구 기능변동

에 관여할 것으로 추측된다.

Protein Phosphorylation in Murine Peripheral Lymphocytes by β Adrenoceptor

Stimulation

De Yeun Oh

Deparment of Medical Science The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Associate Prof, Young Soo Ahn. M.D.)

Reversible protein phosphorylation has been known as an important biological

mechanism of cellular regulation such as carbohydrate metabolism, cell

proliferation, ion transport through cell membrane and also in immunologic system.

Beta adrenergic stimulation causes activation of adenylate cyclase and subsequent

accumulation of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and activation

of cAMP-dependent protein kinase (A-kinase). Lymphocytes possess β adrenoceptors

on their plasma membranes and stimulation of β adrenoceptor causes inhibition of

antibody production, lymphocyte proliferation and T cell mediated cytolysis.

Specific substrate protein for A-kinase is thought to be a final mediator for those

cellular responses.

In this study, therefore, it was attempted to characterize the substrate protein

for the A-kinase after β receptor stimulation in murine peripheral lymphocytes,

Rat peripheral lymphocytes were isolated by centrifugation with Histopaque and

incubated with isoproterenol, propranolol, forskolin, cAMP or H-8.

Proteins were labelled with [(32)**P ] orthophosphate for the intact lymphocyte

or [γ-(32)**P ] ATP for the lymphocyte homogenate. The proteins were separated by

means of two dimensional gel electrophoresis using non-equilibrium pH gradient

electrophoresis and sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis.

Gels were dried and phosphorylated proteins were observed by autoradiogrhphy.

Results obtained were as follows;

1. Beta adrenergic stimulation of the lymphocyte with isoproterenol (10**-5M )

caused intense phosphorylation of a protein having 44 kD mol wt. and pl 6.3 (44

kD/6.3) which was not observed in the absence of isoproterenol stimulation.

2. Phosphorylation of 44kD/6.3 protein induced by isoproterenol was inhibited by

the pretreatment with propranolol (10**-5M ).

3. Activation of adenylate cyclase by forskolin caused a phospherylation of the

44 kD/6.3 protein dose-dependently,

4. The 44 kD/6.3 protein was phosphorylated by the addition of cAMP in the

lymphocyte homogenate,

5. The phosphorylation of the 44 kD/6.3 protein was selectively inhibited by H-8.

6. The 44 kD/6.3 protein was present in lymphocyte membrane fraction but not in

cytosolic fraction.

These results suggest that the 44 kD/6.3 protein may be the substrate protein

phosphorylated by β-adrenergic stimulation and the phosphorylation of this protein

would be related to the functional changes in rat lymphocytes by β-adrenergic

stimulation.