혈우병환자의 말초 T 림프구 기능에 관한 연구

Abstract

[영문]

[한글]

혈우병은 혈액응고인자의 선천적 결핍으로 인한 출혈 때문에 건강성인의 혈액으로 부터

추출한 각종 혈액응고인자 농축제제의 반복적인 투여를 요하는 질병이다.

1980년에 알려지기 시작한 acquired immunodeficiency syndrome (AIDS)의 고 위험군에

혈우병환자들이 포함되면서 이들의 면역기능이상이 AIDS원인바이러스인 Human immunodefi

ciency virus(HIV)에 대한 항체 음성인 건강한 혈우병환자들에서도 발견됨에 따라 이에

대한 연구 조사가 활발히 이루어져 왔다.

혈우병 환자의 면역기능에 대해서는 아직도 일관된 보고가 없으나, 일반적으로 세포성

면역기능의 이상이 공통된 점이며, HIV항체 음성인 혈우병환자에서 이와 같이 면역기능의

이상을 일으키는 원인에 대해서는 응고인자 농축제제에 함유된 동종항원(alloantigen)에

의한 만성 면역복합체의 형성등 여러보고가 있으나 아직 불분명하다.

세포성 면역반응의 측정에 있어서 반고체 한천배지(semi-solid agar medium)을 이용한

T세포 집락형성능 검사는 T세포의 아군만이 증식되고 세포와 세포 접촉을 극소화 시킬 수

있기 때문예 세포성 면역반응의 결함을 분석하는데 더욱 정화성을 부여하는 것으로 보고

되어 있다.이에 본 연구에서는 아직도 명확히 규명되고 있지 않은 혈우병 환자의 면역기

능 상태를 조사하기위해 HIV항체음성인 60명의 혈우병 환자와 40명의 건강인의 말초혈액

림프구(peripheral blood lymphocyte: PBL)를 분리하여 T세포 집락형성을 통한 T세포기능

을 조사함과 아울러 기존의 액체 배양에 의한 PBL의 증식반응, T세포아군의 분포상태, PB

L의 interleukin 2(IL-2) 및 leukocyte migration inhibitory factor (LIF)생성능을 비교

관찰하는 한편, 자연살(natural killer: NK)세포 및 항체의존성 세포독성 (antibody dep

endent cellular cytotoxicity: ADCC) 활성능과 혈청내 면역복합체를 측정함으로서 혈우

병 환자에서의 면역기능의 결함여부와그 기전을 알아보고자 실험을 하여 다음과 같은 결

과를 얻었다.

1. T세포 아형의 분포상태를 단클론항체를 사용한 간접면역형광 검사법으로 조사한 결

과, 환자군에서 CD3, CD4및 CD8양성세포수의 비율은 각각 67.8±19.8%, 32.2±14.7% 및 2

8.8±14.2%이고 대조군은 각자 61.1± 19.3%, 35.2± 11.9% 및 29.9±11.6%로 두 군간에

차이가 없었다.

2. 액체배양을 통한 PHA-p(10ug/㎖)자극에 의한 PBL의 (3)**H -TdR의 섭취량은 환자군

이 142,007±47,400cpm인데 비하여 정상인은 232,000±47,000 cpm으로 환자군에서 PBL의

증식반응이 유의하게(p=0.001) 저하되어 있었다.

3. PHA-p자극에 의한 T세포 집락형성능은 환자군이 2,900±1,600집락수인데 비하여 대

조군은10,800±6,90O으로 환자군에 의의있게(p=0.001) 저하되어 있었다. PHA자극과 동시

에 IL-2첨가에 의해 T세포 집락형성은 두군 모두 증가하는 경향을 보이나 그 집락수는 환

자군에서 11,007±7,700인데 비해 대조군은 19,800±12,700으로 환자군에서 역시 의의있

게 (p=0.001) 저하되어 있었다.

PBL의 집락을 형성한 세포의 CD4및 CD8양성율은 환자군에서 각각 40.6%, 59.4%인 반면,

대조군에서는 각각 69.9%, 30.1%로 환자군에서 CD4 양성집락수가 감소하는 반면에 CD8

양성집락수는 증가되어 있었다.

4. NK 및 ADCC활성능은 환자군에서 각각 31.5±13.3% 및 62.3±13.6%였고 대조군은 36.

6±20.5% 및 67.4±8.3%로 두군간에 유의한 차이가 없었다.

5. PHA-p자극에 의한 PBL의 IL-2생산능은 환자군 및 대조군에서 각각 5.2±3.5 및 4.9

±3.9units/㎖, LIF생산능도 각각 75.4±11.0 및 70.4±10.8로 두군간에 유의 한 차이가

없었다.

6. 혈청내 면역복합체 측정에서 회석도 1:8이상에서의 양성율은 환자군 42.4%, 대조군

6.7%로환자군의 양성율이 의의있게 (p=0.001) 높은 것으로 나타났다.

이상의 결과를 종합하여 볼 때 혈우병 환자 PBL의 NK 및 ADCC의 활성능은 정상인과 유

의한 차이가 없었으나 PHA자극에 의한 림프구의 증식은 정상인에 비해 현저히 저하되어

있었다. 이와같은 T세포 증식의 저하는 T세포의 IL-2생산능 감소에 기인하는 것이 아니라

환자의 혈중내 이상적으로 증가된 면역복합체에 의한 영향일 가능성이 있으며, 그 기전

에 대해서는 앞으로 더 많은 연구조사가 필요할 것으로 사료된다.

Study on Immune Funetion of Peripheral T Lrmphocytes from Patients with Hemophilia

Hee Dae PARK

Department of Medicine The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Professor Jung Keo YOUN, M.D.)

Hemophilia is a disease which is caused by a congenital defect of blood clotting

factors and requires repetitive administration of clotting factor concentrates

extracted from the blood of healthy adults for the prevention and treatment of

eventual bleeding.

Since 1987, this disease has been judged to be one of the high risk groups of

acquired immunodeficiency syndrome and numerous data dealing with various immune

parameters of these patients have been reported.

Though there Have been many controversial reports in this regard, the common

traits found were an abnormal immune function, particularly an impaired cell.

mediated immunity. However, such abnormal immune functions have been also observed

by many authors in hemophiliacs who were negative in antibody detection against

Human immunodeficiency virus (HIV). The reason for the abnormality in immune

function of hemophiliacs without HIV antibodies is not been clearly understood.

To investigate the underlying mechanisms in immune functions of hemophiliacs, we

measured the following series of immune parameters using peripheral blood

Iymphocytes (PBL) from 60 hemophiliacs who were negative in HIV antibody and 40

age-matched healthy controls : determination of T cel] subpopulations, T cell

colony assay in semi-solid agar medium, Iymphocyte proliferation in suspension

culture, in vitro production of interleukin-2 (IL-2) and leukocyte migration

inhibitory factor (LIF), and natural killer (NK) cell and antibody dependent

cellular cytotoxicity (ADCC) activities as well as determination of the serum

immune complex.

1. The surface phenotype of PBL, as determined by the indirect immunofluorescence

method using monoclonal antibodies, revealed no significant differences between

patient and control groups : 67.8±19.8% for CD3, 32.2 ± 14.7% for CD4 and 28.8 ±

14.2% for CD8 in patients, and 61.1± 19.3% 35.2 ± 11.9% and 27.9 ± 11.6%

respectively in controls.

2. Proliferation of PBL-p following PHA·p (10ug/㎖) stimulation in suspension

culture, as determined by tritiated thymidine uptake, was significantly (p : 0.001)

decreased in the patient group as compared to controls: 142,770 ± 47,400 cpm

(S.D.) for patients and 232,700 ± 47,000 cps for controls.

3. In the T cell colony assays, the number of colonies formed fellowing PHA·p

stimulation in the patient group was also signififantly (p=0.001) decreased as

compared to controls: 2,9000 ± 1,600 colonies/plate for patients and 10,800 ±

6,900 colonies/plate for controls. Addition of recombinant IL·2(5 units/㎖) in

these cultures resulted in an increased number of colonies in both groups, while

maintaining a similar degree of difference: 11,000±7,700 colonies/plate for

patients and 19,800 ± 12.700 colonies/plate for controls.

The surface phenotype of cells forming colonies in the T cell colony assays, as

determined by immunobead methods using monoclonal antbodies, showed that all cells

forming each colony expressed the same phenotype, either CD4 or CD8. Colonies

positive for CD4 and CD8 were 40.6% and 59.4% in patients and 69.9% and 30.1% in

controls, respectilly Thus, the decreased CD4 and theincreased CD8 colonies were

observed in the hemophilia group.

4. NK cell and ADCC activities revealed no significant differences between the

two groups: 31.5 ±13.3% for NK and 62.3± 13.6% for ADCC in patients, and

36.6±20.5% for NK and 67.4 ± 8.3% for ADCC in Controls.

5. In vitro production of IL-2 by PBL following PHA-p (10ug/㎖) stimulation

showed no significant difference between the two groups : 5.2±3.5 units/㎖ for

patients and 4.9 ± 3.9 units/㎖ for controls. LIF productivity of PBL from the

same patients also showed no significant difference : 75.4 ± 11.0 for patients and

70.4 ± 10.8 for controls.

6. The rate of immune complex formation in patient sera diluted 1:8 or more was

significantly (p = 0.001) higher than that of the control group: 42% in the patient

group and 6.7% in the control group.

It can be concluded from these results that Iymphocyte proliferation following

PHA stimulation of PBL from hemophilia patients is remarkably decreased, both in T

cell colony assays and suspension cuitures, as compared to a healthy control group.

These abnormalities of peripheral T cell function may not be due to the decreased

IL-2 production of T Iymphocytes, but rather due to the abnormally increased immune

complex found in the sera of these patients.