Free Radical에 의한 DNA손상 및 그 방어에 관한 연구

Abstract

[영문]

[한글]

정상 세포내 신진대사중 생기는 활성화된 산소 대사물 중 superoxide, 과산화수소, hyd

roxyl radical 혹은 singlet oxygen등이 DNA에 손상을 일으킨다는 사실은 많은 연구자들

에 의해서 보고된 바 있다(Gifford 1968; Lown등, 1976; Brawn과 Fridovich 1981). 이 중

hydroxyl radical은 강력한 돌연변이 물질로서 superoxide와 과산화수소의 반응으로 부

터 생긴다는 Haber와 Weiss(1934)의 보고와 과산화수소와 Fe**++ 의 반응에서 hydroxyl r

adieal이 생긴다는 McCord와 Day(1978)의 보고는 많은 실험을 통해서 긍정적으로 또는 부

정적으로 받아 들여지고 있다. 세포내에는 이들 free radical생성을 방어내지 저지시키는

제독 반응계가 존재할 뿐 아니라 특히 이들을 제거하는 효소 반응계가 존재하기 때문에

세포내 이들 농도는 정상에서 비교적 낮게 유지되지만 해독 작용 이상으로 생기면 세포는

손상을 받는 것으로 알려져 있으나 아직 잘 해명되어 있지 않다(Fridovich등, 1970; Rap

oport와 Muller 1974: Hemmen과 Meuling 1975). 이에 저자는 시험관내에서 활성 산소 fre

e radical generating system을 이용하여 생성된 superoxide, 과산화수소, hydroxyl radi

cal이 DNA 절단 및 파괴에 단독 또는 협동적으로 관여하는지의 여부를 밟히고 이들 활성

산소 free radical에 의한 DNA 손상 및 파괴가 여러 효소반응계와 어떤 상호관계를 가지

고 손상이 이루어지며 또 손상이 방어되는 지의 여부를 밟히고자 본 연구에 착수하여 다

음과 같은 결과를 얻었다.

T^^4 phage DNA는 xanthine과 xanthine oxidase로 부터 생긴 superoxide만으로는 손상

을 받지 않았다. 그리고 여기에 superoxide dismutase첨가도 영향을 미치지 못했다. 100m

M의 고농도 과산화수소도 단독으로는 T^^4 phage DNA에 식별할 정도로 별손상을 주지 못

했고 xanthine과 xanthine oxidase에서 생긴 superoxide와 10μM Fe**++ 역시 DNA에 손상

을 주지않았다. Superoxide와 과산화 수소(10mM)의 반응에서도 T^^4 phage DNA strand는

절단되지 않았다. 그러나 1mM의 과산화수소와 10μM의 Fe**++ 으로 부터 생기는 hydrolxy

l radical은 DNA strand를 효과적으로 절단하였으며 DNA손상 정도는 과산화수소의 농도에

비례하였다. 따라서 H^^2 O^^2 는 Fe**++ 존재시 반응계 내에서 OH·을 생성하여 이것이

DNA에 손상을 일으키는 사실을 실험적으로 입증하였다.

Double strand calf thymus DNA도 약 50%는 10μM의 Fe**++ 과 30mM H^^2 O^^2 에서 생

긴 hydroxyl radical에 의해서 파괴되었으며 60mM H^^2 O^^2농도에서는 80%이상이 파괴되

었다. 같은 조건하에서 T^^4 phage DNA가 calf thymus DNA보다 OH·에 의한 손상에 더 예

민하였다. Free radical 제거 물질인 mannitol과 histidine은 모두 10μM의 Fe**++ 과 10

mM의 H^^2 O^^2 로 부터 생긴 hydroxyl radical에 의한 T^^4 phage DNA 손상을 방지할 수

있었고 그 방어 효과는 10mM의 histidine과 50mM의 mannitol이 비슷하였다. Catalase(0.

5 EU)는 10mM H^^2 O^^2 와 10μM의 Fe**++ 반응계에시 생긴 hydroxyl radical에 의한 T^

^4 phage DNA 절단을 방지하였으며 glutathione peroxidase (0.67×10**-3 EU)는 같은 조

건하에서 DNA 손상을 거의 완벽하게 방어하였다. 따라서 glutathione peroxidase의 방어

효과는 catalase의 방어효과보다 약 1,000배 강하였으며 이때 hydroxyl radical에 의한 D

NA 손상 방어에 사용된 효소의 농도는 생리적인 농도에 비해 훨씬 낮았으므로 생물학적인

의의가 대단히 큰 것으로 사료된다.

Studies on the Protection of DNA Strand Breakage Induced by Free Radicals

Won Jin Kim

Department of Medical Science The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Prof. Yoon Soo Kim, M.D., Ph. D.)

It has teen reported that superoxide, hydrogen peroxide, hydroxyl radical or

singlet oxygen, reactive oxygen metabolites of normal cells, cause the DNA

damage(Gifford 1968; Lown et al, 1976; Brawn and Fridovich 1981). It has been

proposed that the hydroxyl radical, a strong mutagen is produced from the reaction

of superoxide and hydrogen peroxide (Haber and Weiss 1934) and from the reaction of

Fe**++ and hydrogen peroxide(McCord and Day 1978). However these two mechanisms are

still controversial.

Many investigators have reported that there are free radical scavengers to remove

these radicals or enzyme systems to prevent the DNA damage from reactive oxygen

metabolites(Rapoport and Muller 1974: Fridovich 1975: Hemmen et al, 1975).

Therefore, the author has designed an experiment to investigate whether reactive

oxygen metabolites which were generatedin in vitro system would influence on the

DNA breakage and destruction by single radical or two radicals cooperatively, and

to study whether free radical scavengers and detoxifying enzyme systems function

effectively in protection of DNA damage from these reactive oxygen radicals.

The results are summarized as follows :

T^^4 phage DNA was not damaged by superoxide generated from xanthine-xanthine

oxidase system and superoxide dismutase had no influence on the DNA damage. Neither

100mM H^^2 O^^2 nor Fe**++ with superoxide produced from xanthine-xanthine oxidase

system caused DNA damage efficiently. T^^4 phage DNA strand had not been broken by

the reaction of superoxide and hydrogen peroxide(10 mM), but hydroxyl radical

generated from 10μM Fe**++ and 1mM H^^2 O^^2 could break the DNA strand

efficiently and the degree of DNA strand breakage was proportional to the

concentration of H^^2 O^^2 . About 50% of calf thymus DNA twas broken by hydroxyl

radical generated from the reaction of 10μM Fe**++ and 30 mM H^^2 O^^2 and more

than 80% of DNA was broken by 10μM Fe**++ and 60 mM H^^2 O^^2 . Both mannitol and

histidine, free radical scavengers, had prevented T^^4 phage DNA damage from

hydroxyl radical generated by the reaction of 10μM Fe**++ and 10 mM H^^2 O^^2 .

The protective effect of 10 mM histidine against DNA damage by hrdroxyl radical was

similar to that of 50 mM mannitol. Catalase(0.5 EU) protected T^^4 phage DNA from

hydroxyl radical generated by 10μM Fe**++ and 10 mM H^^2 O^^2 and glutathione

peroxidase(0.67×10**-3 EU) protected DNA from the damage almost completely under

the same condition. The protective effect of glutathione peroxidase against DNA

damage induced by hrdroxyl radical was about 1,000 times stronger than that of

catalase.

The physiological role of catalase and glutathione peroxidase in preventing the

DNA damage by hydroxyl radical ia significant because the amount of enzyme used in

this experiment was much lower than cellular level.