소와 백서의 신장 transamidinase의 분리 및 구조에 관한 연구

Abstract

[영문]

[한글]

Transamidinase(L-arginine: glycine amidinotransferase, EC 2. 1.4. 1)는 척추동물의

에너지대사에 관여하는 매우 중요한 기질인 creatine의 생합성 과정중 첫번째 반응인 ar

ginine과 glycine으로부터 ornithine과 guanidinoacetic acid가 형성되는 과정을 촉매한

다(Borsook과 Dubnoff 1941). 이 효소의 활성은 Borsook과 Dubnoff(1941)에 의해 포유동

물의 신장에서 최초로 보고된 이래로, 쥐의 뇌 (Defalco와 Davies 1961), 쥐 간장(Gerber

등, 1962), 쥐 고환(Koszalka 1968), 그리고 개 췌장(Walker와 Walker 1959)등 여러 동물

의 여러 장기에서 보고되어 있다.

또한 Van Pilsum등(1972)은 이 효소의 활성을 여러 척추동물과 무척추동물의 각 장기에

서 비교하고, 사람을 포함한 대부분의 동물의 신장과 췌장에서 그 활성이 다른 조직에 비

해 높다고 보고하였다. Transamidinase는 최초로 Ratner와 Rochovansky(1956)에 의해 돼

지 신장에서 분리 정제되었고, 그후 쥐 신장(McGuire등, 1980), 소 신장(Im등, 1983) 등

에서 분리 정제되었으며, 그 분자량은 82,600∼100,000으로서 종의 차이없이 비슷하며,

쥐 (McGuire등, 1980)와 소(Im등, 1983)의 경우 두개의 동일한 소단위로 구성되어 있다고

보고되어 있다.

한편 McGuire등(1980)은 DEAE-cellulose에 의해 쥐 신장 transamidinase는 α와 β의

두 isoenzyme으로 분리되며, 이 두 효소는 그 분자량, 등전점, 항원성 등이 유사하지만,

돼지 신장 transamidinase와는 이온 교환 수지에 부착하는 성질등에 차이가 있다고 보고

하였으며, 소 신장에서 순수 분리한 transamidinase가 Ping-Pong Bi Bi반응기전에 의하여

촉매작용을 하는 것이 밝혀진 바 있다(Im등, 1983). 이와 같이 신장 transamidinase는

그 성질이 종에 따라 많은 차이가 있으며, 또한 분리하는 방법에 따라 단일 단백질 혹은

두개의 isoenzyme으로 분리되는 것을 알 수 있다.

이에 저자는 소와 쥐 신장에서 같은 방법을 사용하여 transamidinase를 분리하고, 이

두 단백질의 분자량, 소단위 구성 여부, 등전점, N-terminal아미노산, 아미노산 구성 성

분 등 구조적인 성질을 분석, 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 소와 쥐 신장 transamidinase는 황산 암모늄처리, Sephadex G-150 gel filtration c

hromatography 및 두번의 DEAE-Sephadex A-50 이온교환 chromatography를 통하여 각각 α

와 β-transamidinase로 분리되었으며, 소 신장에서는 각각 297.3배, 161.8배, 그리고 쥐

신장에서는 각각 219.4배, 99.5배 분리 정제하였다. 이때 specific activity는 소는 각

각3.272, 1.780 μmoles ornithine(orn)/hr/mg protein이었고, 쥐는 각각 2.194, 0.995

μmoles orn/hr/mg protein이었으며, 효소 활성 회수는 소 신장에서는 각각 16%, 4%, 쥐

신장에서는 각각 5%, 2%이었다. 이와 같이 분리된 소와 쥐의 α와 β-transamidinase는 S

DS-PAGE(10%)에서 각각 하나의 단백질로 나타난 사실로 미루어 이 효소가 순수 분리 정제

된 것으로 사료된다.

2. SDS-PAGE(10%)에 의해 소와 쥐의 α와 β-transamidinase의 분자량은 소와 쥐의 경

우 동일하게 α는 약 44,000, β는 약 42,000으로 계산되었으며, Sephadex G-200(superfi

ne) gel filtration chromatography에 의해서는 그 분자량이 각각 약 88,000과 84,000으

로 계산되었다. 이 결과로 미루어 보아 소와 쥐 신장의 α와 β-transamidinase는 두개의

동일한 소단위로 구성되어 있는 효소로 사료된다.

3. Isoelectric focusing gel전기 영동법에 의해 결정된 이 효소의 native형 등전점은

소와 쥐에서 별 차이없이 α-transamodinane는 약 6.4, β-transamidinase는 약 6.2이었

으며, denature 시킨 후 환원시키면 각각 약 7.0, 6.6으로서, 이 효소는 약산성 단백질로

사료된다.

4. Dansylation방법에 의해 소와 쥐의 α와 β-transamidinase의 N-terminal아미노산이

모두 glutamic acid/glutamine으로 되어 있음을 밟혔다. 또한 소와 쥐의 α와 β-transa

midinase의 아미노산 구성 성분을 분석한 결과에 의하면 소의 경우 a와 β-transamidinas

e의 아미노산 구성 성분은 serine, glutamic acid/glutamine, glycine, lysine등의 아미

노산은 소단위당 10개 이상의 차이가 있는 등, 상당한 차이가 있는 반면에, 쥐의 경우에

는 α와 β-transamidinase의 아미노산 구성 성분은 serine과 glycine의 경우 약간의 차

이가 있을 뿐 큰 차이가 없었다. 한편 소와 쥐를 비교해 보았을 때에도 그 아미노산 구성

성분에 차이가 있었다. 이와 같은 구조적인 성질을 종합하면, 소와 쥐 신장 transamidin

ase는 그 일차 구조인 아미노산 배열순서는 동일하지 않으나, 상당히 많은 정도의 sequen

ce homology를 함유하고 있는 단백질로 사료되며, 이런 사실로 미루어 이제까지 알려져

있는 transamidinase의 종에 따른 여러 성질의 차이는 이같은 아미노산 배열 순서의 차이

로 인한 단백질의 2차 및 3차 구조의 차이에 기인하는 것으로 사료된다.

Purification and Structure of Transamidinase from Bovine and Rat Kidney

Young Yoon Kim

Department of Medical Science The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Professor Yoon Soo KiM, M.D., Ph.D.)

Two forms(α and β) of transamidinase(EC 2.1.4.1, L-arginine: glycine

amidinotransferase) have been purified from both bovine and rat kidneys by a series

of steps including ammonium sulfate precipitation, Sephadex G-150 gel filtration

chromatography and DEAE-Sephadex A-50 ion exchange chromatography, and they were

homogeneous as judged by a single band obtained from each enzyme when analyzed by

SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(10%). The molecular weights measured by 9el

filtration chromatography on Sephadex G-200 were 88,000 for bovine and rat

α-transamidinases and 84,000 for bovine and rat β-transamidinases and

SDS-polyacrylamide gel electrophoresis showed the molecular weights of 44,000 and

42,000 respectively, indicating that α and β-transamidinases of both bovine and

rat consist of two identical subunits. Isoelectric points of bovine and rat

α-transamidinases were 6.4 in native rotate and 7.0 under reducing conditions, and

6.2 and 6.6 respectively for bovine and rat β-transamidinases suggesting that the

enzymes are weak acidic proteins. All two forms of bovine and rat transamidinases

have glutamic acid/glutamine as their N-terminal amino acid as determined by

dansylation method. The results of amino acid composition analysis showed that a

and β-transamidinases of bovine kidney have different compositions, the

differences being most prominent in serine, glutamic acid/glutamine, glycine and

lysine residues, whereas rat kidney α and β-transamidinases have quite similar

amino acid compositions except a small difference in serine and glycine residues.

The results also showed that there are differences in amino acid compositions

between bovine and rat enzymes although they have identical N-termini, similar pI

values and molecular weights. From these results, it is concluded that α and

β-transamidinases from both bovine and rat contain a large degree of sequence

homology even though their amino acid sequences are different, and therefore it is

suggested that the known species differences of transamidinases are due to the

differences in secondary and tertiary structures of these proteins resulting from

their different primary amino acid sequences.