차세대 염기서열 분석법을 이용한 상염색체 STR 유전자의 염기서열변이 분석과 혼합시료 분석에의 활용

Abstract

최근에 차세대 염기서열 분석법(Next generation sequencing, NGS)을 이용하여 범죄수사에 널리 이용되는 짧은 연쇄반복 (short tandem repeat, STR)을 분석하고자 하는 시도들이 있었다. NGS 기법은 기존 모세관전기영동(Capillary electrophoresis, CE) 분석법에 비해 빠른 시간 내에 대용량의 염기서열 정보를 생성할 수 있다는 장점에 기반하여 여러 연구자들에 의해 기존의 CE 분석법을 대체하거나 부가적으로 사용할 수 있는 도구로써 주목 받고 있다. 그러나 NGS 기법을 이용한 STR 분석을 효과적으로 수행하기 위해서는 NGS 분석의 특성에 맞게 최적화시킨 새로운 다중중합효소연쇄반응 체계를 구축할 필요가 있다.이러한 목적을 위해서 본 연구에서는 18개의 표지자 (Combined DNA Index Syetem STR 13개, D2S1338, D19S433, Penta D, Penta E, Amelogenin)를 대상으로 NGS 장비가 한번에 읽을 수 있는 길이를 고려하여 70 bp ~ 210 bp 범위에서 증폭산물을 얻을 수 있도록 최적화시킨 새로운 다중중합효소연쇄반응 체계를 구축하였다. 새로 구축된 다중중합효소연쇄반응 체계를 이용하여 2800M과 9947A 표준시료 및 한국인 10명의 시료, 표준시료를 여러 비율(1:1, 1:3, 1:6, 1:9)로 혼합한 시료를 대상으로 증폭산물을 생성하고, 이들을 대상으로 NGS 분석을 수행하여 각 STR의 대립유전자형과 반복단위 내부에서 관찰되는 염기서열 변이를 조사하였다. NGS 분석결과로 얻어진 자료로부터 coverage 수를 산정하고 단일시료분석에서는 분석 기준 값을 20%, 1:1, 1:3, 1:6 혼합시료에서는 10%, 1:9 혼합시료에서는 5%의 기준 값 및 stutter 기준 값(15%)을 적용하였다. 결과적으로 NGS 분석에서 결정된 단일시료 및 혼합시료의 STR 대립유전자형은 기존 CE 분석에서 결정된 대립유전자형과 일치함을 확인하였다. 또한, 서로 다른 시료로부터 유래한 유전자형을 구별할 수 있도록 하는 STR 반복단위 영역 내부의 염기서열 변이는 두 개의 표준시료 및 한국인 10명 시료의 D2S1338, D3S1358, D8S1179, D21S11, vWA 위치에서 확인되었다. 또한 실제로 혼합된 비율을 추정하기 위하여 CE 분석의 peak 높이와 같이 NGS 분석에서 얻어진 coverage 수에 기초하여 혼합비율 추정하거나, 염기서열 변이의 원형(wild-type)과 변이형(mutant type)의 비를 이용하였다. 그 결과 NGS 분석으로 추정된 혼합비율은 실제 혼합비율을 추정하는 데에는 한계가 있었지만 CE 분석법에서 관찰된 혼합비율과 비슷하게 나타나는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 구축된 다중중합효소연쇄반응 체계를 이용한 STR의 NGS 분석방법은 법과학 실무에서 단일시료뿐만 아니라 혼합시료의 분석에도 유용하게 적용될 수 있을 것으로 생각된다.