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TGF-β에 의해서 유도되는 EMT에서 PKCK2의 역할 규명 및 활성조절 연구

Other Titles
 The role of PKCK2 in TGF-b mediated EMT and regulatory mechanism of PKCK2 activation 
Issue Date
2013
Description
의과학과/석사
Abstract
암세포 전이란 암세포가 스스로 침윤성과 운동성을 갖게 되는 것인데 이러한 과정 중 하나가 Epithelial - mesenchymal transition (EMT)이며 그 중 E- to N cadherin switching은 EMT가 일어날 때 중요한 전제 조건이다. Transforming growth factor b (TGF-b)는 세포 성장, 분화에서 중요한 역할을 하며 암세포 형성 초기에는 tumor suppressor로 작용하지만 암이 완벽하게 형성이 되었을 때에는 EMT를 유발 시킨다고 알려져 있다. Protein Kinase Casein Kinas 2 (PKCK2)는 serine/threonine kinase 로써 세포 성장, 사멸 및 증식에서 중요한 역할을 하며 특히 환자의 암 조직 및 인간 암 세포주에서 활성이 증가되어 있으며 최근 보고에 따르면 EMT 에도 관여하여 암 전이와 침윤현상을 조절한다고 알려져 있지만 그 활성 기작이 정확히 밝혀진 바 없다. 따라서 본 연구에서는 TGF-b에 의해서 EMT가 일어날 때 PKCK2가 관여 하고 있으며 PKCK2의 활성과 TGF-b가 연관이 있을 것이라 판단되어 둘이 어떠한 상관관계가 있는지 알아 보았다. 우선 인간 폐암 세포주인 A549 세포에 PKCK2의 활성을 낮춘 상태에서 TGF-b를 처리한 후 EMT를 확인해 본 결과 PKCK2의 활성이 없을 경우 TGF-b를 처리하더라도 EMT가 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 게다가 A549 세포에 PKCK2a를 단독으로 과발현 시켰을 경우 TGF-b를처리하지않더라도 EMT가 이루어졌으며 이를 통해 TGF-b에 의해 유도되는 EMT에서 PKCK2활성이 필수요소인 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 토대로 TGF-b가 PKCK2의 활성을 조절할 것이라 판단하여 TGF-b를 처리한 뒤 in vitro kinase assay를 통해서 PKCK2의 활성이 증가되는 것을 확인 하였고 TGF-b수용체억제제 (SB431542)를 처리하여 PKCK2의 활성증가가 실제로 TGF-b에 의한 것임을 확인하였다. 이러한 PKCK2의 활성 조절이 Smad pathway를 경유하는지 확인해 보기 위해 PKCK2 활성을 억제시킨 후 TGF-b를 처리하였고 그 결과, PKCK2의 활성을 억제시켰음에도 불구하고 Smad pathway는 여전히 진행되고 있음을 확인하였다. 게다가 promoter assay와 Smad4의 세포 내 위치 확인을 통하여 PKCK2 활성과 무관하게 TGF-b를 처리하면 Smad pathway가 진행되는 것을 확인하였다. 또한, shRNA Smad4를 이용하여 Smad pathway를 억제시킨 후 TGF-b를 처리하여 PKCK2의 활성을 확인하였고 그 결과 Smad pathway를 억제시켜도 TGF-b에 의해 PKCK2의 활성은 증가하였으며 이에 따라 EMT도 유발되는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과로 TGF-b에 의해서 PKCK2의 활성이 조절될 때 Smad pathway를 경유하지 않는 것을 확인하였다. 그렇다면 TGF-b에 의한 PKCK2의 활성조절이 Non-Smad pathway를 통해서 이루어지는지 확인해 보고자 TGF-b 수용체와 PKCK2a 또는 PKCK2b의 결합여부를 확인했지만 수용체들과 PKCK2a 또는 PKCK2b는 결합하지 않았고, TGF-b신호가 이루어질 때에 PKCK2a또는 PKCK2b의 인산화가 이루어 질 것이라 예측하여 TGF-b수용체 (TbR1)이 항상 활성을 띄도록 TbR1 constitutively active construct (TbR1 CA)를 제작하여 PKCK2a와 면역침전법을 수행하였고 그 결과, TbR1이 PKCK2a의 threonine 잔기를 인산화 시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한 TbR1 CA와 PKCK2a를 in vitro kinase를 통해서 TbR1이 PKCK2a를 직접 인산화시키는 것을 확인하였다. 이렇게 PKCK2a의 인산화가 이루어지면 PKCK2a는 regulatory subunit인 PKCK2b로부터 분리 되어 활성이 증가되는 것을 확인 하였다. 또한 A549 CK2a세포에 PKCK2b를 넣어줌으로써 PKCK2의 활성이 감소하는 것을 통하여 PKCK2b로부터 PKCK2a가 분리되면 PKCK2의 활성이 증가하는 것을 다시 확인하였고 감소된 활성에 의해 A549 CKaCK2b 세포에서 EMT의 반대현상인 MET가 일어나는 것을 확인하였다. 종합하여 볼 때 TGF-b는 PKCK2a를 인산화 시키고 이로 인해 PKCK2a는 PKCK2b로부터 분리되어 활성이 증가하게 된다. 이렇게 TGF-b에 의해서 PKCK2의 활성이 증가하게 되면 EMT가 유발되고 이로 인해 암세포의 전이가 일어나게 된다.
URI
http://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/134785
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2. 학위논문 > 1. College of Medicine (의과대학) > 석사
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