재조합된 E2F-1 프로모터에 의한 종양 특이적 복제 가능 아데노바이러스 개발 및 저산소 조건에서의 재조합 HRE 인핸서 효과 검증

Abstract

2009년 WHO 통계에 따르면, 우리나라 암환자의 생존율은 57.1%로 미국, 캐나다 등의 나라에 비해서 10-20% 정도 낮은 생존율을 보이고 있고, 이로 인해서 새로운 치료법의 필요성이 점차 커지고 있는 현실이다. 유전자 치료는 기존 암 치료법을 대체하기위해 새롭게 연구되고있는 치료법이며, 유전자 치료 방법 중 하나인 종양 선택적 살상 아데노바이러스는 이전에 개발되었던 복제 불능 아데노바이러스와 비교했을 때 좋은 치료 효과와 암세포 살상율이 높게 나타남이 보고되었다. 본 실험실에서 개발된 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 Ad-dE1B19는 야생형 아데노바이러스의 유전자 중 E1B19 kDa을 제거한 바이러스로서 매우 효율적인 암세포 살상능을 보여주었으나, 정상 세포들도 죽이는 한계점을 가지고 있었다.따라서 본 연구에서는 정상 세포가 아닌 암세포만을 살상하는 효과를 얻기 위하여 암세포 특이적 살상 아데노바이러스를 제작하였다. 이를 위해서 암세포에 많이 발현되는 E2F-1 전사인자가 결합할 수 있도록 재조합된 E2F-1 프로모터를 아데노바이러스에 넣음으로써 암세포 특이적인 아데노바이러스의 복제 조절을 유도하였다. 재조합된 E2F-1 프로모터 중, E2F-1이 결합하는 결합핵심부위을 반복 염기 형태(E2Ftr)로 존재할 때에 대조군인 E2Ftr가 없는 Ad-E2F-d19보다 더 향상된 프로모터 활성을 보였고 결과적으로 더 나은 암세포 살상능을 나타냈다. 이러한 경향은 cytopathic effect assay뿐만이 아니라 MTT assay에서도 관찰되었다. 그리고 viral productivity assay는 재조합된 E2F-1 프로모터의 향상된 전사 활성으로 인해 아데노바이러스가 더 많이 복제되었음을 보여주었고, 그로인해 cytopathic effect assay와 MTT assay에서 관찰되었던 향상된 암세포 살상이 이루어졌음을 알 수 있었다. 하지만 E2F-1 프로모터는 저산소 조건에서 그 활성이 떨어진다는 보고1가 있어서 이를 극복하는 과정이 필요하고, 또한 암조직의 특징 중 하나인 저산소 조건에서 아데노바이러스의 선택적 프로모터의 활성을 증가시켜야 한다. 이를 위해서 hypoxia response element (HRE) 결합핵심부위을 재조합하여 프로모터의 활성을 향상시킬 수 있는지를 확인하였다. 재조합된 HRE 프로모터 중, HRE30tr이 포함된 pdE1sp1A/HRE30tr/E2F/GFP 플라스미드가 제일 향상된 프로모터 활성을 보여주었으며, 이를 토대로 GFP를 발현하는 복제 불능 아데노바이러스를 이용한 실험에서도 HRE30tr/E2F/GFP가 가장 향상된 프로모터 활성을 보여주었다. 이 연구를 바탕으로 재조합된 E2F-1 프로모터 중 가장 좋은 활성을 보인 Ad-E2Ftr/E2F-d19, Ad-MYCtr/SP1tr/E2Ftr/E2F-d19, Ad-NFYtr/ATFtr/E2Ftr/E2F-d19, Ad-CUXtr/E2Ftr/E2F-d19에 저산소 조건을 극복하기 위한 재조합 된 HRE 프로모터 중 HRE30tr를 결합한다면 효과적인 암세포 선택적 살상 아데노바이러스가 될 것으로 기대된다.