은나노입자에 의하여 유도되는 in vitro 세포독성 및 염증반응

Abstract

현재 나노 기술은 여러 가지 방식으로 상용화 되었다. 특히 은나노입자는 뛰어난 살균성으로 세정제, 공기청정스프레이, 혈관 내 삽입용 카테테르로 응용되어 사용된다. 이러한 나노입자의 활발한 응용에 따라 독성 기작에 관한 연구 역시 매우 다양하게 시행되고 있다. 본 연구에서는 나노입자가 인체 내로 피부, 호흡기, 혈관과 같이 여러가지 유입경로로 들어와 결국 혈액을 통해 전신 순환을 하게 되는 것을 전재하고 사람단핵구세포주인 U397을 모델로 하여 세포독성(cytotoxicity) 및 염증유발인자들을 확인하였다. 생체 내 환경에서 입자 크기의 안전성을 유지하기 위해 polyvinylpyrrolidone(PVP) 로 표면이 코팅 된 각각 다른 크기의 합성된 은나노입자, 5 nm, 20 nm, 그리고 80 nm를 U937세포주에 처리하였다. 24시간 후 세포증식률(cell proliferation rate)을 측정한 결과 5 nm의 은나노입자로 처리한 U937 세포는 6.25 μg/mL 농도에서, 20 nm의 은나노입자로 처리 시 25 μg/mL에서 증식률이 급격히 떨어지는 것을 관찰하였으며 각각의 반수치사량(lethal dose 50: LD50)은 4.00 μg/mL, 7.96 μg/mL이였다. 실험을 수행한 농도 범위인 0∼50 μg/mL 내에서는 80 nm의 은나노입자에 의한 세포독성, 즉 세포증식률은 대조군에 비해 큰 변화가 없었다. 이와 같은 세포독성은 광학현미경(light microscopy)으로도 관찰할 수 있었는데, 5 nm와 20 nm의 은나노입자로 처리한 후 독성 농도에서 세포의 이상 모양을 관찰 하였고, 80 nm의 은나노입자로 처리 후에는 대조군에 비해 세포의 모양이 크게 변하지 않았다. 또, 투시전자현미경(transmission electronic microscope: TEM) 사진으로 은나노입자가 크기에 상관없이 모두 세포 내로 유입되어 세포질에 존재하는 것을 확인하였다. 또, 5 nm와 20 nm의 은나노입자를 세포독성이 심한 농도로 처리하고 3시간 후 세포의 미토콘드리아 모양이 변하는 것을 확인하였고, 세포질에서 특이적인 소기관의 모양이 발견 되었다. 5 nm 와 20 nm의 은나노입자에 의한 세포독성이 세포사멸(apoptosis)에 의한 것인지를 판단하기 위해 Annexin-V와 Propidium iodide (PI)를 염색한 후 유세포분석(flow cytometry)을 이용한 결과 Annexin-V와 PI 두 가지 모두 양성으로 반응하였으므로, 후기 세포사멸로 사료되는 급격한 세포독성기작을 보였다. 또, 세포크기가 커지고 세포내에 은나노입자의 자극에 대해 특이적으로 과립자 형성이 많아지는 것을 확인하였다. 실험에 사용한 은나노입자 중 크기가 작은 5 nm, 20 nm 입자를 처리한 U937 세포주에서 활성화산소(reactive oxygen species: ROS)와 interleukin(IL)-8과 같은 염증성 인자들의 유발을 관찰하였는데 이는 5 nm의 은나노입자로 자극한 U937 세포는 활성화산소 유발이 더 급격히 증가한 반면, 사이토카인(cytokine)인 IL-8의 생성은 20 nm의 은나노입자로 자극한 U937세포에서 더 증가함을 보였다. 세포막의 미세사 중합을 억제하여 내포작용(endocytosis)을 저해하는 물질인 cytochalasin D를 전처리 한 후에는 은나노입자에 의해 유발되는 활성화산소와 IL-8의 생성이 억제된 것으로 보아 염증성 사이토카인의 생성과 활성화산소의 유발은 모두 은나노입자가 세포내로 신속하게 유입되어 나타나는 염증 반응임을 알 수 있었다. 위와 같은 결과들을 바탕으로 PVP로 코팅된 구형의 은나노입자 5 nm, 20 nm, 80 nm 중에서 크기가 작을수록 낮은 농도에서 세포독성을 보였고 활성화산소가 유발 되는 특징과 IL-8이 생성 되는 것을 관찰하였으며 미세사 중합을 억제하여 내포작용을 저하시키는 cytochalasin D로 U937을 전처리 한 후 은나노입자로 자극 할 때에는 이러한 염증 유발 관련 기작이 억제되었으므로 은나노입자는 세포내로 쉽게 유입되어 단핵구세포주의 염증 반응을 유도한다고 결론지을 수 있다.본 연구의 결과를 바탕으로 은나노입자에 의한 활성화산소의 유발 기작 및 염증성 사이토카인인 IL-8의 생성 관계를 알아보는 연구가 추후 시행되어야 한다. 또한, 유발된 활성화산소는 DNA의 염기 서열을 바꾼다고 알려져 있으므로 이에 의한 유전독성 연구가 절실하다. 더불어, 세포사멸 이나 세포괴사와 같은 기작에 대한 연구를 비롯하여 임상적 염증 유발에 대한 가능성에 대해 고려해 볼 필요가 있다.