Gal4-UAS 시스템을 이용한 췌장 특이적 Musashi-1 과발현 제브라피쉬 형질전환주

Abstract

최근에 췌장암의 발병률과 치사율이 높아지면서 의학적, 실험적인 연구에 대한 관심이 높아지고 있다. 하지만 높은 관심에도 불구하고, 췌장암의 정확한 원인과 기작에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다. Musashi-1(Msi1)은 RNA-binding protein으로서 배아 발달에서 표적 mRNA의 번역(translation)을 조절한다고 알려져 있다. 그러나 Msi1 의 기능과 조절에 대해서는 아직 명확하지가 않다. 다양한 양성, 악성 종양에서는 Msi1 의 과발현이 관찰되며, 이것은 Msi1 이 암생성에 관여한다는 것을 나타낸다. 제브라피쉬는 발생생물학 연구와 종양생물학 연구에 아주 유용한 모델로서 각광을 받고 있다. 따라서 본 연구는 실험동물인 제브라피쉬를 이용하여 암생성에 관련된 유전자 (Musashi-1)에 의한 췌장암모델 형질전환 제브라피쉬를 수립하고,Msi1 의 발현에 따른 특정한 변화를 관찰하고자 함에 있다. 형질전환 제브라피쉬를 수립하기 위한 방법으로 Gal4-UAS 시스템을 사용하였으며, 형질전환 유전자의 construct, pUAS-GFP-UAS-Msi1 (대조군 pUAS-GFP)을 생물표지자 GFP와 Msi1 의 췌장 특이적 발현을 위해, 1-cell stage ptf1a-Gal4 transgenic embryo에microinjection하였다. 또한 형질전환 효율을 높이기 위하여, Tol2-mediated transgenesis 방법을 사용하였다. 수립된 형질전환 제브라피쉬에서 Msi1 의 발현은 후뇌, 척수, 망막, 외분비 췌장에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 제브라피쉬의 초기 배아의 발생에서 Msi1 의 비정상적인 과발현은 트립신 유전자에 대한 Whole-mount In situ hybridization으로써 확인해본 결과, 외분비 췌장의 분화를 지연시켰다는 것을 확인할 수 있다. 또, 비정상적인

Msi1 의 발현으로 분화에 연관되는 유전자를 확인해 보기 위해서, 4 개월 된 성어의 췌장을 분리하여 microarray분석을 하였다. microarray분석에서 대조군(ptf1a-GFP)과 Msi1 제브라피쉬에서의 2 배 이상의 변화량을 비교분석 하였을 때, 2 배 이상의 발현 변화를 나타낸 636 개의 유전자중, 434 개의 유전자가 높은 발현량을 보였고, 202 개의 유전자가 낮은 발현량을 보임을 확인할 수 있었다. 그 중에서 분화지연과 암생성에 관련된 유전자를 선별하여 RT-PCR을 수행하였다. 결론적으로 이연구에서는 형질전환 제브라피쉬에서 Msi1 의 비정상적인 발현을 췌장의 분화 및 암의 형태적인 변형을 확인해 볼 수 있다. 또한, 이러한 형질전환 제브라피쉬의 수립은 췌장암 생성연구에서 암과 관련된 유전자의 역할을 규명하는데 도움이 될 것이다.