사람 정자에서 정자 특이적 양이온 통로, CatSper의 발현

Abstract

[한글]

남성의 생식세포인 정자는 고환에서 정자형성과정을 통하여 생성된다. 그러나 고환에 존재하는 정자는 운동성을 갖지 못하며, 정상적으로 난자를 수정시킬 수 있는 능력, 즉 수정능획득 과정 또한 이루어지지 않은 상태이다. 그 후, 정자는 부고환으로 이동되면서 운동성과 수정능획득 과정을 거치게 된다. 특히 정자의 운동성은 사정된 정자가 여성의 자궁과 수란관을 지나 배란된 난자까지 이동해 가기 위해 필수적이며, 이후 난자 주변의 세포층과 투명대를 뚫고 수정에 성공하기 위해서 꼭 필요한 요소이다. 이러한 정자의 운동성에 관여하는 물질로는 칼슘이온과 cyclic nucleotide가 가장 중요한 것으로 알려졌으며, 특히 칼슘이온은 정자의 운동성과 수정능획득에 필수적인 물질로 알려져 있다. 칼슘이온의 작용은 정자의 세포막에 존재하는 칼슘통로를 통해 세포 외부에 존재하는 칼슘이온이 정자 세포 내로 단시간에 과량이 운반되어 세포 내부의 칼슘이온 농도가 높아지게 됨으로써 이루어진다. CatSper는 최근에 새롭게 밝혀진 양이온 통로로서, 정자의 미부 세포막에 존재하면서 세포 외부의 칼슘이온을 정자세포 내로 운반하여 정자의 운동성을 조절하는 것으로 보고 되었다. 그러나 CatSper에 관한 연구는 생쥐의 고환과 정자 및 사람의 고환을 대상으로 하여 이루어진 것으로 사람의 정자에 대한 연구보고는 없는 실정이다. 따라서 본 연구는 사람 정자를 대상으로 하여 CatSper의 발현을 조사하고, 사람 정자의 운동성과 CatSper의 상관관계에 대하여 알아보고자 하였다.

사람 정자로부터 추출한 RNA로부터 nested RT-PCR 방법을 이용하여 CatSper mRNA가 존재하는지를 확인한 결과 CatSper mRNA는 실험에 사용한 정자시료 모두에서 발현되었다.

Nested RT-PCR을 통하여 얻은 CatSper mRNA의 발현양을 반정량적인 값으로 환산하고, 이 발현값이 정자의 운동성이나 직진성과 관련이 있는지를 알아본 결과 WHO 기준에 의한 정상군과 무력정자증군 사이에서는 CatSper mRNA 발현양의 유의한 차이가 없었으며, 살아있는 정자의 운동성을 기준으로 하여 두 군으로 나누었을 경우에는, 살아있는 정자의 운동성이 50% 초과인 군의 발현값은 1.5±0.6인 반면, 살아있는 정자의 운동성이 50% 이하인 군의 발현값은 1.2±0.6으로 나타났다. 이는 운동성이 좋은 군의 CatSper mRNA 발현양이 그렇지 못한 군에 비해 25% 정도 많다는 것을 의미하나 통계적인 유의성은 없었다 (p=0.141). 또한 정자의 직진성을 1.7을 기준으로 하여 두 군으로 나누었을 때도 직진성이 높은 군의 CatSper mRNA 발현양이 직진성이 낮은 군에 비해 23% 정도 높은 것으로 확인되었으나 이 역시 통계적 유의성은 없었다 (p=0.168).

사람 정자에서 CatSper 단백질이 발현되는가를 알아보고자 사정된 사람 정자시료를 대상으로 CatSper 단백질에 대한 항체를 이용하여 형광 면역세포화학법을 시행한 결과, CatSper 단백질은 사람 정자에서 발현되며 그 발현 위치는 정자의 미부인 것으로 확인되었다. 발현부위를 세분화해보면, 미부의 네 부분 중 최말단인 end piece를 제외한 connecting piece, mid- piece, principal piece의 세 부분에서 CatSper 단백질 발현이 확인되었다. 또한 관찰한 정자의 거의 모두에서 이러한 CatSper 단백질의 발현을 관찰할 수 있었으며 그 발현 정도는 조금씩 차이가 있는 것으로 관찰되었다.

이상의 결과에서, 생쥐 정자에서와 마찬가지로 사람 정자에서도 CatSper 유전자가 발현되어 그 mRNA와 단백질이 존재하는 것이 본 연구에 의해 처음으로 확인되었다. 또한 통계학적으로 유의하지는 않았지만, 사람 정자의 운동성이나 직진성이 높을수록 CatSper mRNA가 더 많이 발현되는 경향성을 보였다. 따라서 남성 불임과 연관하여 CatSper 유전자의 돌연변이로 인한 양이온 통로로서 CatSper의 기능적 손상이나 상실에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

[영문]In the testis, spermatozoa are incapable of progressive motility and unable to fertilize an egg. Progressive motility and capacitation of sperm are crucial for fertilizing oocytes. Progressive motility is acquired during transit through the epididymis, and the capacitation is attained after incubation within the female reproductive tract. Numerous studies demonstrated that calcium ion and cyclic nucleotide control sperm motility and capacitation. Especially, calcium ion has been focused as the primary determinant of sperm cell behavior and extracellular calcium seems to be required for all of these physiological processes.

CatSper, a newly identified cation channel in mouse sperm and human testis, is reported to exist in flagellum of mouse spermatozoa. CatSper has a closest similarity to pore forming α1 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav), including six-transmembrane-spanning domain, glutamate/aspartate residues of pore region and lysine/arginine repeats of voltage sensor region. In knock-out mice for CatSper, mutant sperm shows impaired progressive motility and sterility in vitro fertilization because they fail to penetrate zona pellucida of oocytes. Moreover, the mutant sperm is incapable of inducing intracellular calcium elevation by cyclic nucleotide. So it is concluded that CatSper is a sperm specific cation channel and plays a key role in the sperm motility and fertility in mouse.

In this study, we aimed to elucidate the expression and intracellular localization of CatSper in human spermatozoa. Moreover, we investigated the relationship between CatSper expression and motility of ejaculated human spermatozoa. To our best knowledge, this is the first report to show the expression of CatSper mRNA and protein in human spermatozoa. We confirmed the expression of CatSper mRNA in ejaculated human spermatozoa by nested RT-PCR. Moreover, we found that CatSper protein was dominantly expressed in flagellum of human sperm. Using double fluorescent immunostaining with anti-CatSper and anti-β-tubulin antibody, we concluded that CatSper protein was localized in connecting piece, mid-piece and principal piece of flagellum, not in end piece. In each sperm population, a few sperms showed very weak immunostaining of CatSper protein. This suggested that expression of CatSper protein may be heterogeneous in same sperm population and each sperm expresses CatSper protein at a different amount. Using nested RT-PCR and semi-quantitative analysis of CatSper mRNA, we compared the expression of CatSper mRNA with sperm motility, motility/viability ratio and progressiveness. In comparison of CatSper mRNA expression and sperm motility (not distinguishing dead sperms from whole sperm population), the mean value of CatSper mRNA expression (mean±SD) was 1.5±0.6 in normozoospermia (n=18) and 1.4±0.6 in asthenozoospermia (n=21). There was no statistical significance between two groups. When compared the expression of CatSper mRNA with motility/viability ratio (group A; > 0.5, group B; ¡A0.5), group A (n=31) was 1.5±0.6 whereas group B (n=8) was 1.2±0.6. The mean value of group A was 25% higher than that of group B but it was not significantly different. In comparison of CatSper mRNA expression with progressiveness (group A''; >1.7, group B''; ≤1.7), group A'' (n=28) was 1.6±1.0 whereas group B'' (n=11) was 1.3±0.6. The mean of group A'' was 23% higher than that of group B'' but there also was no statistical significance.

In conclusion, we demonstrate for the first time that ejaculated human spermatozoa expresses mRNA and protein of CatSper and CatSper protein is dominantly localized in flagellum including connecting piece, mid-piece and principal piece. There was no immunoreactivity in end piece of flagellum. We failed to show the significant difference of CatSper mRNA expression between normozoospermia and astheno- zoospermia. But we found the tendency of increasing CatSper mRNA expression according to increase of motility/viability ratio and progressiveness in ejaculated sperm. Moreover, most of sperm population expressed CatSper protein in immunocytochemical study. So further studies are focused on the mutation of CatSper gene resulting in functional loss or impairment of CatSper as a cation channel.