천포창 혈청이 각질형성세포의 세포고사에 미치는 영향

Abstract

[한글]

천포창 (pemphigus)은 피부와 점막에 수포를 형성하며 조직학적으로 각질형성세포와 각질형성세포 사이의 결합이 풀어지는 현상, 즉 극세포해리(acantholysis)를 특징으로 하는 만성 수포성 질환이다. 천포창 환자는 혈청 내에 cadherin 가족에 속하는 desmoglein (Dsg)에 대한 자가항체를 가지고 있으며 이 자가항체가 교소체 (desmosome) 구성 성분인 desmoglein에 결합함으로써 극세포해리 (acantholysis)를 일으키는 자가항체에 의한 자가면역 수포성질환이다. 한편 세포고사가 천포창의 병변에서 흔히 발견되는데 어떤 기전으로 세포고사가 발생하며 세포고사가 천포창에서의 수포 발생에 어떤 역할을 하는지에 대해서는 잘 밝혀지지 않았다. 이에 본 연구는 천포창 환자 혈청이 각질형성세포의 세포고사에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.

본 연구에서는 천포창 혈청을 투여한 HaCaT 세포를 48 시간 동안 배양한 후에Annexin-V 와 propidium iodide (PI) 염색을 이용한 FACS 분석과 TUNEL 염색을 이용하여 세포고사를 관찰하였다. 또한 western blot을 통하여 세포고사에서 중요한 역할을 하는 caspase-8, caspase-3의 활성과 poly[ADP-robose] polymerase (PARP)의 절단 그리고 미토콘드리아로부터 세포질 내로 방출되어 나온 cytochrome c를 측정하였으며, 세포고사가 혈청 내의 Fas ligand 때문인지, IgG 자가항체 때문인지를 알아보기 위하여 ELISA를 이용하여 천포창 혈청과 정상인 혈청 내의 Fas ligand 단백 농도를 비교 측정하였다. 또한 천포창 혈청 내의 IgG를 제거한 천포창 혈청을 HaCaT 세포에 투여하여 세포고사가 일어나는지 알아보았다.

실험결과 천포창 혈청을 투여한 후 48 시간 동안 배양한 HaCaT 세포에서 FACS 분석을 통하여 세포고사를 관찰할 수 있었으며, TUNEL 염색에서도 세포고사를 확인하였다. Western blot을 시행하여 caspase-8의 전구체인 procaspase-8이 감소하였음을 관찰할 수 있었으며, executioner caspase인 caspase-3의 활성화와 PARP의 절단을 관찰하였다. 또한 미토콘드리아에서 세포질 내로 방출되어 나온 cytochrome c도 측정함으로써 세포고사 유발을 확인하였다. 한편, 천포창 혈청 내의 IgG를 제거한 천포창 혈청을 투여한 HaCaT 세포에서는 procaspase-8의 단백 양 변화를 관찰할 수 없었고, caspase-3의 활성화 역시 발견할 수 없었다. ELISA를 통한 천포창 혈청 내의 Fas ligand 단백 농도 측정 결과, 천포창 혈청과 정상인 혈청의 Fas ligand 단백 농도의 유의적인 차이는 발견할 수 없었다.

이상의 결과로 천포창 혈청은 caspase-8과 caspase-3의 활성화와 미토콘드리아로부터의 cytochrome c 방출을 통하여 HaCaT 세포의 세포고사를 유도하며, 이것은 천포창 혈청 내의 Fas ligand 보다는 IgG 자가항체의 영향 때문인 것으로 사료된다.

[영문]Pemphigus is an autoimmune blistering disease of the skin and the mucous membrane characterized by loss of adhesion between keratinocytes, a process known as acantholysis. The target molecules of autoantibodies are desmogleins which belong to cadherin family proteins of desmosome. Independently from the autoantibodies involved, the question whether apoptosis plays a role in the pathogenesis of pemphigus has never been addressed. The purpose of this study was to determine if pemphigus sera induce apoptosis in HaCaT cells and to elucidate the mechanism of pemphigus sera induced apoptosis.

We treated pemphigus sera on HaCaT cells for 48 h and investigated whether apoptosis was induced or not through FACS analysis and TUNEL staining. In addition, we performed western blot analysis to detect cleavage of PARP, cytosolic cytochrome c and activation of caspase-8, -3, which play a major role in apoptosis. Soluble Fas ligand protein level in pemphigus sera were compared with the level in normal sera by ELISA. IgG removed pemphigus sera were treated on HaCaT cells to elucidate the role of IgG in pemphigus-sera-induced apoptosis.

As a result, using FACS analysis with Annexin-V and PI staining, we have shown that pemphigus sera induced apoptosis in HaCaT cells. TUNEL staining assay also confirmed the apoptosis were induced in HaCaT cells after treatment of pemphigus sera. Western blot analysis showed activation of caspase-3, release of cytochrome c, cleavage of PARP and decrease of procaspase-8 which is proform of active caspase-8 – in HaCaT cells treated with pemphigus sera. We could not detect increased Fas ligand protein level in pemphigus sera compare with the level in normal sera. Moreover, since the removal of IgG obliterated the inducing apoptosis effects of pemphigus sera in HaCaT cells, IgG may be involved in the activation of caspase-8 and caspase-3.

With these results, we concluded that treatment of pemphigus serum induces the apoptosis of HaCaT cells through, at least in part, activation of caspase-8, caspase-3 and cytochrome c related mechanism, and that IgG in serum is involved in the mechanism rather than Fas ligand.