PCR-RFLP를 이용한 Mycobacterium 감염의 진단 및 균종 감별

Abstract

[한글]

Mycobacterium spp.에 인한 감염은 만성전염병으로 전 세계에 중요한 질병 중에 하나이다. 이로 인한 지속적인 환자의 발병 및 사망은 human immunodeficiency virus (HIV) 감염에 따라 지속적으로 증가추세를 보이면서 Mycobacterium 감염이 단순한 질병이 아닌 심각한 감염으로 대두되고 있다. 더욱이 1980년대 초반부터 Mycobacteria other than M. tuberculosis (MOTT) 또는 atypical mycobacteria라고 명명되는 균종에 의한 감염이 증가되면서 Mycobacterium 감염의 신속한 진단 및 원인 균종의 감별과 이에 따른 효과적인 치료의 중요성이 부각되고 있다.

Mycobacterium spp.의 감별은 현재까지 생화학적 검사나 배양 검사에 의한 것으로 배양 시 진단에 수주 이상의 시간이 소요되는 단점이 있으며 정확한 정보를 얻을 수 없는 경우도 있다. 최근 high performance liquid chromatography (HPLC), thin-layer chromatography, DNA 염기서열 분석 등의 새로운 감별법들이 제시되고 있지만 조작에 어려움이 있어 통상적으로 적용하기에 어려운 상태이다. 그리고 amplified DNA 및 probe hybridization을 통한 분자생물학적 검사가 개발되어 진단과 균종 감별을 비교적 신속하게 할 수는 있으나 고가의 비용을 필요로 하기 때문에 현재로선 임상에 도입하기 어려운 실정이다.

유전자 분석을 이용한 감별법인 rpoB 유전자에 대한 PCR-restriction fragment length ploymorphism (PCR-RFLP) 방법은 Mycobacterium spp. 간의 공통 유전자를 이용한 것으로 임상검체로부터 Mycobacterium 감염을 조기에 진단하고 균종을 감별하여 적절하고 신속한 치료제를 선택하는데 도움을 주고자 하였다.

이에 본 연구에서는 기존에 동정된 Mycobacterium spp.를 PCR-RFLP하여 동정된 균종과 비교함으로써 PCR-RFLP가 Mycobacterium 감염 진단 및 균종을 감별하는데 있어서 유용성이 있음을 확인하였다. 또한 세포 수에 따른 민감도를 알아보기 위해 sputum에 혼합된 균 분리의 PCR 결과는 5 CFU

ml에서도 가능함을 볼 수 있었다. 이러한 높은 민감도는 PCR-RFLP 방법이 Mycobcterium 감염을 진단하는 현명한 대안일 수 있으며 이를 통해 Mycobcterium spp.의 원인 균종을 감별하여 실험실적 정도 관리에도 도움을 줄 수 있으므로 검사의 질적 향상을 기대할 수 있는 것으로 사료되었다.

따라서 Mycobacterium 감염이 의심되거나 그 균종을 감별하기 위해 환자의 검체에서 DNA 추출, PCR을 통해 검체에 rpoB 유전자가 있음을 보고 Mycobacterium의 감염을 일차적으로 확인하였다. 그리고 이것을 배양 검사와 PCR-RFLP를 실시하였을 때 그 결과는 모두 일치하였다. 즉, 균의 감염이 모두 양성이었으며 이 가운데 비정형 결핵 확진 환자의 경우, PCR-RFLP를 통해 M. avium으로 균종을 더 명확히 구분 지을 수 있었다. 따라서 PCR-RFLP가 Mycobacterium 감염 진단 및 균종 감별에 중요한 인자로 작용함을 볼 수 있었으며, 이는 염기서열 분석에서도 동일한 결과가 나와 PCR-RFLP를 통한 검사 결과를 뒷받침해 주었다.

또 다른 방법으로 조직 검사와 함께 PCR-RFLP를 실시한 결과 Mycobacterium 감염 양성이 모두 일치하였다. 이 가운데 비정형 결핵균의 균종이 M. intracellulare임을 확인하였으며 이는 또한 염기서열 분석을 통해서도 같은 균종이 나왔음을 확인했다. 이것은 치료제를 사용하여 환자의 호전된 정도를 보았을 때의 결과와도 같은 것이었다. 따라서 PCR-RFLP를 통한 결과가 Mycobacterium 감염 진단뿐만 아니라, 원인 균종 감별, 치료제 선택에 도움을 줄 수 있는 충분한 근거가 될 수 있음을 확인하였다.

Mycobacterium 감염 진단 및 균종을 감별하기 위해 PCR-RFLP를 임상 진단과 비교하였는데 Mycobacterium 감염 양성 혹은 음성 결과가 모두 일치하였다. 또한 이것을 PCR-RFLP 하였을 때 Mycobacterium spp.의 균종을 M. tuberculosis로 감별하므로 감염 환자 진단을 더욱 확정할 수 있는 지침이 될 수 있음을 볼 수 있었다. 그리고 염기서열 분석에서도 같은 결과가 나와 PCR-RFLP를 통한 검사 결과를 뒷받침해 주었다.

11명의 환자를 통해 알아본 Mycobacterium 감염 양성 혹은 음성을 감별하는데 있어서 배양 검사, 조직 검사 및 임상 진단은 PCR-RFLP의 결과와 모두 일치하였다. 그리고 PCR-RFLP 방법을 통한 균종의 감별은 배양 검사 2건 모두, 조직 검사 4건 중 2건, 임상 진단에서 2건 중 1건의 검사 결과와 일치함을 확인했다.

이 같은 결과를 바탕으로 현재 수 주 이상 인력이 소요되었던 생화학적 검사나 배양 검사에 의존한 Mycobacterium spp.의 진단을 Mycobacterium spp.에 공통적으로 존재하는 rpoB 유전자로부터 PCR-RFLP 방법을 이용하여 진단 및 원인 균종을 조기 감별할 수 있었다.

[영문]Mycobacterial infection is one of the major public health problems in the world. Identification of Mycobacterium spp. in clinical specimens is primarily based on culture and biochemical tests. These conventional tests take several weeks and sometimes fail to provide precise identification. In contrast to these techniques, PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) offers an easy, rapid, and inexpensive way to identify Mycobacterium spp. PCR-RFLP technique is a rapid method for identifying the species of Mycobacterium spp. from clinical specimens.

In this study, I evaluated the usefulness of PCR-RFLP for rapid diagnosis and species identification of Mycobacterium spp. from clinical specimens.

Conserved gene of RNA polymerase of Mycobacterium spp. was amplified by PCR. The amplified 360 bp region of rpoB was digested with restriction enzymes MspI or HaeIII. And the PCR-RFLP patterns of each Mycobacterium spp. were determined. PCR-RFLP patterns of Mycobacterium spp. isolated from several clinical samples were compared with restriction fragment band patterns of control.

Mycobacterium spp. isolated from clinical samples were identified as M. tuberculosis, M. fortuitum, M. intracellulare, or M. avium. And the results of PCR-RFLP were nearly identical to those of culture, biopsy, clinical diagnosis, or sequencing.

In conclusion, PCR-RFLP is a rapid and useful method for the identification of Mycobacterium spp. from clinical specimens. This study suggest that this method would contribute to the rapid diagnosis and treatment of mycobacterial infections in clinical setting.