Telomerase 조절부위 및 adenovirus death protein이 아데노바이러스의 세포살상능에 미치는 영향

Abstract

[한글]

암세포에서만 선택적으로 증식하여 암세포를 살상하는 종양세포 특이 증식 아데노바이러스는 기존의 복제 불능 아데노바이러스에 비해 일차 감염세포뿐 아니라, 바이러스 복제와 확산에 의한 주변 세포로의 재감염을 통해 훨씬 증가된 항종양 효과를 유발할 수 있다. Human telomerase reverse transcriptase(hTERT)는 염색체 복제동안 telomere의 길이를 일정하게 유지하는데 관여하는 효소인 telomerase의 구성요소로써, 세포노화와 암, 그리고 세포불멸에 관여하는 것으로 알려졌다. Telomerase의 활성은 사람의 경우 난소와 고환의 생식세포, 그리고 임파구에서 관찰되나 그외 정상 체세포에서는 관찰되지 않는 반면, 암진행 전단계인 양성종양조직과 암세포주 및 암조직에서는 telomerase의 활성이 증가된다. hTERT의 활성을 조절하기 위한 최소의 프로모터 크기는 181 bp이며, hTERT 프로모터에는 c-myc의 결합부위인 E-box와 Sp1 결합부위가 포함되어 있다. 본 연구에서는 hTERT 프로모터의 암세포 특이성과 활성을 증가시키기 위한 방안으로 c-myc 결합부위와 Sp1 부위를 첨가한 개선된 m-hTERT 프로모터를 제작하여, 이를 세포 살상능이 월등히 우수한 복제 가능 아데노바이러스인 Ad-Δ19의 복제를 조절하는 E1 유전자의 내재 프로모터와 치환하여, 암세포 특이성이 부여되고 세포 살상능이 우수한 아데노바이러스인 Ad-TERT-Δ19와 Ad-mTERT-Δ19를 제작하여 이들의 암세포 특이성과 항종양 효과를 비교ㆍ평가하고자 하였다. LacZ 유전자를 표지유전자로 야생형 hTERT 프로모터와 변형된 m-hTERT 프로모터의 암세포 특이성과 활성정도를 비교 검증한 결과, telomerase의 활성이 높은 암세포에서는 m-hTERT 프로모터의 활성이 hTERT 프로모터에 비해 현격히 증가된 반면 telomerase의 활성이 거의 없는 정상세포에서는 m-hTERT 또는 hTERT 프로모터 모두 거의 활성이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다. 세포 살상능을 비교 검증한 oncolytic assay와 MTT assay에서도 Ad-mTERT-Δ19의 세포 살상능이 암세포에서는 Ad-Δ19와 유사한 수준이지만 정상세포에서는 약 100배 정도 낮아 m-hTERT 프로모터의 암세포 특이적 조절능을 확인할 수 있었다. 생체내에서의 항종양 효과를 비교 검증한 실험에서도, Ad-mTERT-Δ19를 투여한 경우 Ad-TERT-Δ19에 비하여 항종양 효과가 우수하였으며, 이는 Ad-Δ19와 거의 유사한 수준으로 나타났다.

또한, 기존의 암세포 특이적 복제가능 바이러스인 E1B55kD 가 소실된 Ad-Δ55 (YKL-1)은 암세포 특이적 세포살상을 유도하나 야생형 바이러스에 비해 살상효과가 현저히 떨어지는 결과를 보였다. 따라서 본 연구에서는 암세포 특이적 복제가능 바이러스의 세포 살상능을 증가시키는 방안으로, 세포내에서 복제된 아데노바이러스의 방출을 촉진하는 E3 ADP 유전자를 재삽입시켜 바이러스에 감염된 세포의 효과적인 세포사멸을 유도하고자 하였다. ADP 유전자의 고효율 발현을 위해서는 CMV 프로모터에 의해 ADP의 발현이 유도되는 Ad-Δ55-cA가 내재 프로모터인 MLP에 의해 ADP의 발현이 유도되는 Ad-Δ55-mA보다 세포 살상면이나 바이러스의 인접세포로의 확산면에서 월등히 뛰어난 효과를 보였고, 항종양 효과면에서도 CMV 프로모터에 의해 ADP가 발현되는 Ad-Δ55-cA가 월등히 뛰어남을 보였다. 또한, ADP가 숙주세포의 세포고사를 유도함으로써 복제 가능 아데노바이러스의 암세포 살상을 증가시킴을 FACS와 TUNEL 분석을 통해 확인하였다.

이러한 결과를 바탕으로, mTERT 프로모터에 의해 바이러스 복제가 조절되고, 암세포 특이적 복제가능 바이러스의 세포살상능을 증가시키기 위해 E3 부분에 ADP를 삽입한 Ad-mTERT-Δ19-cA 바이러스를 제작하였다. Ad-mTERT-Δ19-cA 바이러스는 대부분의 암세포에서 Ad-mTERT-Δ19에 비해 증가된 세포살상능을 보였으며, BJ와 같은 정상세포에서는 세포살상능이 Ad-mTERT-Δ19와 유사한 정도로 나타나 향상된 암세포 특이적 세포살상을 확인할 수 있었다.

이상의 결과를 통해 m-hTERT 프로모터에 의해 복제가 조절되는 복제가능 아데노바이러스 또는 m-hTERT 프로모터에 의해 발현이 조절되는 세포살상 유전자를 암치료에 이용한다면, 암조직에서의 세포살상 효과는 현격히 증대하는 반면, 정상조직에서의 활성은 아주 낮아 이에 따른 암 유전자 치료의 안전성과 항종양 효과가 크게 증대되리라고 생각된다. 또한 ADP 유전자를 통한 증가된 암세포 살상능으로 암치료에 필요한 투여량을 감소시켜 바이러스에 의한 독성을 감소시킬 수 있을 것으로 생각된다.

[영문]Replication-competent adenoviruses (Ads) are promising new modality for the treatment of cancer. Selective replication of a viral agent in tumor may lead to improved efficacy over non-replicating Ads due to viral multiplication, lysis of the infected cancer cell and spread to surrounding cells. Human telomerase reverse transcriptase (hTERT) is the catalytic subunit of telomerase that is responsible for stabilizing telomere length during the replication of chromosome. The hTERT promoter is highly active in virtually all types of tumors and immortal cells, but is usually inactive in most normal somatic cells. To improve activity and cancer cell specificity of hTERT promoter, more copies of c-myc sequence and Sp1 sites were incorporated into the downstream of hTERT promoter, generating a m-hTERT promoter. The activation of hTERT or m-hTERT promoter was significantly up-regulated only in hTERT-positive cells, but not in hTERT-negative cells. For the aim of restricting viral replication to tumor cells, the adenoviral E1 gene that is essential for viral replication has been placed under the control of the hTERT or modified m-hTERT promoter, generating conditional replication competent adenoviruses, Ad-TERT-Δ19 and Ad-mTERT-Δ19, respectively. The in vitro efficacy and specificity of the hTERT and m-hTERT promoter have been evaluated by the comparison of viral replication and cytopathic effect in cancer cells and normal cell lines. While the wild type Ad-TERT-Δ19 replicated in and induced cytopathic effect in cancer and in some normal cell lines, Ad-mTERT-Δ19 enhanced viral replication and cytopathic effect in cancer cells only. In addition, the growth of established human cervical carcinoma in nude mice was significantly suppressed by intratumoral injection of Ad-mTERT-Δ19.

We have previously shown that the E1B 55kD-deleted Ad, Ad-Δ55 (YKL-1) exhibits tumor specific replication and cell lysis, but with reduced cytolytic effects in comparison to wild type adenovirus. Thus, improving the potency of oncolytic adenovirus remains an important goal for cancer gene therapy. To increase the oncolytic ability of Ad-Δ55 we have reintroduced adenovirus death protein (ADP) gene under the control of CMV or MLP promoter at E3 region of Ad-Δ55, generating an Ad-Δ55-cA and Ad-Δ55-MA, respectively. ADP is an 11.6kD protein encoded by the E3 transcription unit, and is required to efficiently kill adenovirus-infected cells. However to date, the mechanism by which ADP mediates cell death has not been clearly defined. In this study, we report that ADP-overexpressing Ad markedly enhanced cytolytic effect (up to 1000-fold) against all tumor cell lines tested, but did not increase CPE in normal skin fibroblast, BJ. Moreover, plaque size formed by Ad-Δ55-cA was substantially larger than that of Ad-Δ55, indicating enhancement in cell lysis. TUNEL assay and Annexin-V

PI double staining indicate that ADP-mediated cytotoxicity was largely driven by apoptosis. Finally, Ad-Δ55-cA adenovirus also showed superior antitumor effect than Ad-Δ55 and Ad-Δ55-MA in C33A cervical and Hep3B hepatoma xenograft tumor models.

To further improve tumor cell specific cytotoxicity of Ad-mTERT-Δ19, we have introduced ADP gene under the control of CMV promoter at E3 region of Ad-mTERT-Δ19, generating an Ad-mTERT-Δ19-cA. Ad-mTERT-Δ19-cA showed markedly increased tumor cell killing effect in comparison of that of Ad-mTERT-Δ19 or wild type adenovirus. But, in normal cells, BJ, Ad-mTERT-Δ19-cA showed similar cell killing effect as that of Ad-mTERT-Δ19.

Taken together, results strongly suggest that the use of mTERT promoter is not only useful in regulation of therapeutic gene expression but also that replication-competent oncolytic adenovirus under the control of mTERT promoter may be a new promising tool for the treatment of human malignancies. Also, ADP-overexpressing adenovirus elicits enhanced cytopathic effect by induction of apoptosis, which is critical for adding therapeutic value to replicating adenovirus for cancer gene therapy.