Development of novel HIV-1 gene transcription repressors

Abstract

[한글]

인간 면역 결핍 바이러스 (Human Immunodeficiency Virus, HIV)는 사람에게 후천성 면역결핍증(Acquired Immunodeficiency Syndrom, AIDS)을 유발하는 인간 레트로바이러스(retrovirus)로 1983년 프랑스 Pasteur 연구소에서 최초로 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 (HIV-1)이 분리되었다. 세계 보건기구 WHO와 UNAIDS 자료에 의하면 전 세계의 HIV 감염자수가 4,000여만 명에 이른다. 현재까지 개발되어 사용되는 의약품들은 바이러스의 여러 복제과정을 억제하는 화합물이나 백신 개발 방향으로 진행되어 왔다. 최근에는 이런 다양한 약물들을 섞어서 사용하는 칵테일 요법이 권장되고 있다. 실제로 칵테일 요법을 받고 있는 환자의 혈액에서 에이즈 바이러스의 지표로 사용되는 HIV RNA가 검출되지 않을 정도로 효과를 보이고 있다. 현재 HIV RNA 바이러스 자체가 가지는 자연적인 유전자의 변이 때문에 궁극적인 치료제가 없다.

HIV-1 바이러스 유전자의 생산은 HIV LTR 지역에서 주로 일어난다. HIV-1 바이러스 유전자는 TATA box 부위에 작용하는 일반 전사기구에 의해 최소한의 전사가 일어나며 여기에 Sp1이 작용하여 실제적인 전사가 일어나게 된다. 최근에 IST(inducer of short transcript)부위에 작용하는 전사조절 단백질(FBI-1)이 확인되어, 유전자 표현을 조절하는 것으로 알려져 있으나, 그 기능은 확실하지 않다. HIV-1 바이러스는 전사가 일어나면서 short transcript라는 미완성의 RNA 가닥이 만들어지고 일시적으로 promoter 부근에 머물면 CDK9에 의한 RNA 중합효소Ⅱ와의 상호작용 및 이에 의한 인산화가 바이러스 유전체의 표현에 가장 중요하다.

우리는 숙주세포의 게놈에 자리잡고 있는 HIV-1 proviral 유전체의 전사과정을 억제함으로써 HIV-1 바이러스 유전자의 생산을 억제할 수 있는 방법, 에이즈 바이러스 증식 억제자를 디자인하고 제조에 성공하였다.

본 실험실에서 Sp1 전사인자의 활성을 극적으로 억제하는 단백질인 FBI-1을 발견하였고, 또한 발현 조절부위 주변에 머물러 있는 짧은 RNA 가닥을 효과적으로 인식할 수 있는 단백질(TATdMt)를 발견하였다. 우리는 전사과정을 막아버리는 방법이 HIV-1 바이러스 유전자 표현 및 복제를 효과적으로 억제 할 수 있다는 생각을 하게 되어, Sp1 계열 전사인자 억제 단백질과 POZ-domain, HDAC1 그리고 IST에 결합하는 단백질로 FBI-1을 TATWt 혹은 TATdMt에 융합시킨 단백질을 만들어 전사활성을 측정한 결과 FBI-1-TATdMt 융합 단백질이 TaTWt에 의한 전사활성화를 강력하게 억제할 수 있다는 결과를 얻었다. 전사 억제에 효과가 뛰어난 FBI-1-TATdMt를 HIV viral genome에서 envelop protein이 제거된 viral genome 과 VSV-G vector와 TatdMt fusion vector와 cotransfection 하여 HIV virus particle을 생산한 후 이들을 각각 HeLa T4 cell에 넣어서 HygR selection과 Magi cells에 넣어서 colony의 숫자를 세거나 X-Gal staining 하였다. HeLa T4 cell에 dilution rate에 따라 control에서는 colony 수가 많이 관찰 되었고 FBI-1-TATdMt 경우 colony 수가 극적으로 줄어드는 결과를 얻을 수 있었다. 한편 Magi cells에의 경우 control에서는 X-gal로 염색된 푸른색의 세포 수가 많이 관찰된 반면, FBI-1-TATdMt 경우 푸른색의 세포 수가 현저히 감소함을 볼 수 있었다.

효과적인 치료제로서 이용되기 위해서는 우리가 개발한 다른 유전자의 발현에 영향을 주어서는 안된다. 우리는 FBI-1-TATdMt 등의 단백질의 인위적인 세포 내에서의 표현이 다른 단백질의 발현에 영향을 주는지 western blot을 통하여 발현 양상을 본 결과 다양한 부류의 다른 단백질에 영향을 주지 않음을 알았다. 또한 Tat protein이 apotosis를 유발시킨다는 보고가 있어, FBI-1-TATdMt 등의 여러 단백질들이 apoptosis를 유발하는지 조사하였다. TatWt 단백질은 강력한 apotosis를 유발하는데 비하여, 우리가 제조한 융합 단백질들이 apotosis를 유발하지 않음을 알 수 있었다.

또한 전사 억제 효과가 가장 뛰어난 FBI-1-TATdMt 융합 단백질의 어느 부위가 전사 억제 기능에 중요한 가를 여러 mutagenesis 과정을 통하여 여러 변형 형을 제조하고 세포에 투입하여 그 기능을 조사하여 보았다. 그 결과 FBI-1의 POZ domain, zinc-finger 부분, TatdMt 부분 모두 전사를 억제시키는데 중요한 부위 임을 발견하였다.

우리는 FBI-1 전사인자가 인간 세포가 생산하는 유전자이기 때문에, 유전자 치료 벡터 등의 방법으로 도입하면, 많은 인간 유전자의 표현에 관여하여 영향을 미칠 수 있다고 판단되어, 인간의 유전자의 프로모터에 결합하지는 않고 proviral 상태의 HIV-1 LTR에만 선택적으로 작용하고, LTR의 9-12 bp 염기서열을 특이적으로 인식할 수 있는 인공 징크핑거를 도입하고자 하였다. 툴젠 회사와 공동 협력하여 주로 Sp1 자리에 붙는 10개의 인공 전사인자를 만들었다. 이들 인공 전사인자에 POZ-domain, TATdMt 등을 융합한 단백질을 만들었다. 인공 전사인자 융합 단백질들은 HIV-1 LTR-CAT 유전자가 stable하게 삽입된 HeLa 세포에 transfection 하여 reporter 유전자 발현을 분석함으로 전사 억제활성을 측정한 결과, POZ-인공 전사인자-TatdMt 융합 단백질이 FBI-1-TatdMt보다 더욱 강력한 전사 억제 기능과 HIV-1 바이러스 유전자 생성을 극적으로 억제함을 발견하였다.

추가 연구를 통하여, 본 연구를 통하여 개발된 방법을 이용하고, 전사억제 물질들은 에이즈 유발 바이러스에 감염된 세포에 선택적으로 보낼 수 있는 방법이 개발되게 되면, 전사 억제를 통한 새로운 에이즈 치료가 가능할 것으로 예상된다.

[영문]The Tat protein of human immunodeficiency virus-1 is a potent trans-activator of viral gene expression. We found that the POZ-domain of FBI-1 represses Sp1 activity. We prepared proteins that fuse the FBI-1 or the POZ-domain of FBI-1 with the TatdMt (TatWt K28A, K50A) which lacks the ability to interact with P-TEFb but interacts more strongly with TAR than TatWt. The TatdMt fusion polypeptides were targeted specifically to the HIV-1 LTR, and potently repressed both transcription and replication of HIV-1. In particular, the FBI-1-TatdMt was the most strong transcription repressor and inhibited virus replication by 230 fold. The POZ-domain, zinc-finger DNA binding domain, and TatdMt are functional domains of the FBI-1-TatdMt protein important in transcription repression. The deletion or mutation in any of the three regions reduced repressor activity. The fusion proteins had no detectable apoptotic activity. Our data suggest that the fusion proteins that contain transcription repressor domain and zinc-finger can act as a potent transcription repressor by being fused with TatdMt. Several artificial zinc fingers recognizing various regions of HIV-1 LTR were designed and prepared by collaborating with Toolgen Inc. The artificial zinc finger proteins recognizing the Sp1 binding site (-64 bp ~ -56 bp and -67 bp ~ -59 bp) of HIV-1 LTR repressed transcription in stable HeLa cells integrated with HIV-1 LTR. Artificial zinc fingers fused with the POZ domain and the TatdMt were at least as potent repressors as FBI-1-TatdMt, and they abolished transcription activation of HIV-1 LTR by TatWt.