Comparison of biologic and genomic phenotypes in in vivo selected clones of gastric orthotopic animal model

Abstract

[한글]

우리나라에서 가장 많이 발생하는 위암은 조기에 발견하게 되면 완치가 가능하나, 침윤과 전이가 일어나게 되면 현존하는 치료방법으로 완치가 불가능하다. 이와 같은 한계점을 해결하기 위하여 많은 연구자들이 암의 침윤 및 전이가 일어나는 원인에 대한 분자 생물학적 및 유전학적 연구를 노력을 기울이고 있다. 이러한 연구를 하기 위해서 적절한 생체내 동물모델을 이용한 실험이 필요로 한다. 현재 가장 많이 사용되는 암 관련 연구 모델은 대개 피하에 종양세포를 투여하여 종양이 형성된 xenograft model을 사용하고 있다. 그러나 원발암의 미세환경과 다른 피하에서의 종양형성능이나 전이능은 실제 환자에서의 암의 성상과 다르다는 것을 쉽게 생각할 수 있다. 즉, 원발암의 원발 장기에 암세포를 투여하여 그 장기에 암이 생성되고 이후 침윤과 전이 과정을 나타내는 동물모델이야말로 종양생리를 정확하게 이해하고 그에 관한 약제 개발에 적절하게 응용될 수 있다. 특히 위암의 경우는 원발 장기인 위에 암을 유발하는 것이 기술적으로 많은 제한점이 있었으나, 최근 본 외과학교실에서 위암의 동소이식모델을 완성할 수 있게 되어 이를 이용하여 원발 위암의 특성을 갖는 in vivo selected clone에서 유래한 cell line을 이용하여 그 생물학적 및 유전학적 특성을 비교하고자 하였다.

본 연세의료원, 연세암전이연구센터에서 확립한 YCC-3 위암 세포주를 이용하여 누누생쥐의 피하에 종양을 형성한 후 그 종양 조각을 위점막에 이식하여 종양이 형성되는 동소이식모델을 이용하였다. 매 원발암을 다시 확보하여 그 종양조각을 다음 생쥐의 위점막에 이식하는 계대배양을 시행하며 매번 세포주를 확립하였다. 먼저 각 계대마다 종양형성 및 전이 양상을 관찰하였다. 이후 형성된 세포주들의 생물학적 특성을 확인하기 위하여 먼저 세포주의 형태를 관찰하고, 생쥐의 피하에 주사하여 생체내 종양형성능을 확인하였다. 생체외 특성으로 세포성장속도를 tumor doubling time으로 측정하였고, 생체외 종양형성능과 세포의 이동능을 anchorage independent soft agar assay와 Boyden chamber assay를 이용하여 각각 관찰하였다. 각 세포주의 유전체학적인 성상을 평가하기 위하여 각 세포주의 total RNA를 추출한 후 17K 인간유전자가 점적되어있는 cDNA microarray에 보합하여 발현을 관찰하였다.

8-12주 경과 관찰하여 위암 동소이식모델이 형성된 후, 그 위암 조직을 다시 계대 배양을 하였을 때, 세대가 증가함에 따라 원발위암의 형성을 잘 되었고 주변 림프절의 전이 양상이 다양하게 관찰되었다. 그러나 초기 3계대 까지는 간과 비장 전이가 유발되었으나 그 이후에는 간전이가 감소함을 관찰하였다. 계대배양한 원발성 위암 조직을 이용하여 확립한 세포주들은 현미경적 성상은 유사하였으나 생체외 종양형성능은 YCC-3 세포주에 비하여 점차 계대가 늘어날수록 종양 형성능이 증가하는 것을 확인하였다. 생체외 생물학적성상을 관찰한 결과, YCC-P-7 세포주로 갈수록 YCC-3 세포주에 비하여 세포의 성장 속도는 빨라지고 이동능이 감소하는 경향을 관찰하였고, 생체외 종양형성능은 감소하였다. cDNA microarray를 이용한 유전자 발현결과 parent YCC-3 세포주와 기타 7개 계대배양세포주는 확연히 다른 양상을 가지고 있음을 확인하였고, 7개 세포주간에는 초기 4개 세포주와 후기 3 세포주간의 유사성을 확인하였다. 이와 같은 양상은 특히 세포 성장에 관련되는 유전자들을 선정하여 비교하였을 때도 동일한 결과를 확인할 수 있었다.

암 연구에서 가장 중요한 동물 모델 중 실제 암의 자연경과를 가장 잘 반영하는 동소이식 모델을 이용하여, 그 한계점인 재현성을 극복하고자 동소이식 모델에서 유래된 세포주를 확립하였다. 특히 본 세포주들은 원발 위암 조직의 계대배양을 하면서 확립되어서 원발 위암의 특성 및 발암기전을 잘 반영하리라고 생각되고, 본 세포주들의 생물학적 특성 및 유전체학적 변화 자료는 원발 위암의 발생 및 진행과 관련된 기초 자료로 유용하며 이를 이용한 연구에 유용하게 사용될 수 있으리라 생각한다.

[영문]Gastric cancer is the most common type of cancer in Korea with an unfavorable prognosis. Therefore, it is important to understand the mechanisms of gastric cancer development, invasion and metastasis. Even though enormous efforts have been made to solve these problems, the currently used in vitro and in vivo model systems have many limitations. Specifically, it is essential to choose the proper in vivo model system according to the aims of the particular study. The orthotopic animal model system is suitable for examining the pathophysiology of tumor cells as well as their interaction with the host microenvironment reflecting the nature of the human tumor. Based on an orthotopic gastric cancer animal model system established in the Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine, this study evaluated the biological and genomic characterization of the cell lines established from the in vivo selected clones, which reflects the primary gastric cancer properties for understanding the pathophysiology of gastric cancer development.

A piece of a subcutaneous xenograft tumor formed from YCC-3 gastric cancer cells was inoculated in the gastric mucosa of nu/nu mouse. When the primary tumor was developed in the gastric mucosa, the tumor was procured and a cell line was established from the primary gastric tumor. The same procedure was repeated for 7 passages and the resulting cell lines were called YCC-3-P1 - P7. When observing the in vivo patterns of tumor development, 94% developed primary tumors with various lymph node (LN) metastases. However, a systemic metastasis to liver or spleen decreased as the number of passages increased. Even though the cell lines established from the in vivo selected clones showed the same morphology under a microscope, the extent of in vivo tumorigenesis is increased with increasing number of passages to YCC-3-P7. The tumor doubling time, the motility and the anchorage independent tumor growth decreased with the increasing number of passages. The genome wide expression showed discrete patterns between the parent YCC-3 cells and other 7 daughter cell lines. When the patterns were evaluated with 317 cell growth related genes, the YCC-3-P1-4 and P5-7 cells showed the different genomic patterns.

In conclusion, this study suggests that combining the ex vivo cell line with an orthotopic model system may be a useful tool for investigating the pathophysiology of gastric cancer. According to the aim of the study, the best model system might be chosen based on the biological and genomic characterization. In addition, the current results might be helpful for understanding the pathophysiology of human gastric cancer.