VSV-G epitope이 삽입된 증식가능 아데노바이러스를 이용한 유전자 전달 및 세포 살상 효율 분석

Abstract

[한글]

아데노바이러스는 생체내 유전자 전달 효율이 우수하여 암치료용 벡터로 많이 이용되고 있으나 임상 시험결과 인체의 종양조직에는 아데노바이러스의세포수용체인 Coxsackie and Adenovirus Receptor(CAR)의 발현이 낮아 암세포로의 유전자 전달 효율이 낮다는 문제점이 제기되고 있다. 따라서 본 연구에서는 암세포로의 아데노바이러스의 감염 효율을 증대시키기 위한 방안으로, 인체 세포주의 세포막에 다량으로 발현되어 있는 phosphatidyl serine(PS)과 결합할 수 있는 VSV-G 막단백질의 epitope을 이용하여 암세포로의 감염 효율 증가를 유도하였다. 즉, 다양한 숙주세포로의 감염을 매개하는 VSV-G epitope을 아데노바이러스의 fiber 말단 부위에 삽입하여 CAR와의 결합능 이외에 PS를 통해서도 세포를 감염시킬 수 있는 아데노바이러스를 제작하였다. LacZ를 표지 유전자로 발현하고 fiber 말단에 VSV-G epitope이 삽입된 복제 불능 아데노바이러스인 dl-LacZ-VSVG의 경우, 야생형 fiber를 가진 대조군 아데노바이러스인 dl-LacZ 바이러스에 비해 유전자 형질 도입율이 현저히 증가하였으며, 특히 CAR의 발현이 매우 낮은 세포주들에서의 유전자 전달 효율이 약 20배 정도 증가함을 관찰하였다. 또한, 복제 가능 아데노바이러스의 세포 살상능을 비교 검증할 수 있는 CPE assay와 MTT assay를 통하여, 대조군 암세포 특이적 살상 아데노바이러스인 YKL-1에 비해 VSV-G epitope이 삽입된 암세포 특이적 살상 아데노바이러스인 YKL-VSVG에 의한 세포 살상능이 월등히 우수함을 확인할 수 있었다. 이러한 YKL-VSVG 아데노바이러스의 증가된 암세포 살상능은 생체내 항종양 실험에서도 확인되었다. 이러한 결과들은 본 연구에서 제작된 VSV-G epitope이 삽입된 아데노바이러스들이 CAR 수용체 뿐만 아니라 PS를 통해서도 세포를 감염함으로서 유전자 전달 효율과 세포 살상능이 증가될 수 있음을 의미한다. 이는 결과적으로 CAR에 의존적으로 세포를 감염하는 기존의 아데노바이러스를 이용한 암 유전자 치료 효과의 한계를 극복할 수 있어 암 유전자치료에 보다 더 안전하고 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 기대된다.

[영문]

Recombinant adenovirus has become the choice of vector system for cancer gene therapy. However, the utility of adenoviral vectors has been limited due to the low efficiency of adenovirus-mediated gene transfer to cancer cells, which express low level of CAR on their surface. By developing strategies to achieve adenovirus infection via alternate receptor pathway, enhanced and more specific gene delivery can be achieved. To increase the efficiency of adenovirus-mediated gene transfer to cancer cells, we generated novel recombinant adenoviruses, dl-LacZ-VSVG and YKL-VSVG, which contain a fiber knob with intact CAR-entry capability and an additional PS-entry capability by incorporating the VSV-G epitope onto the C-terminus of the fiber knob. VSV-G is an envelop protein of VSV that facilitates the specificity for the binding of the virus to a PS-moiety on the cellular plasma membrane. In this study, we show that dl-LacZ-VSVG substantially increased the gene transfer efficiency in a variety of cancer cells including CAR-deficient cells. The largest improvement of gene transfer was observed for the cells that were difficult to transduce with untargeted Ads. In addition, we demonstrate that the oncolytic potential of YKL-VSVG was greatly improved by enhanced infectivity. Furthermore, treatment with YKL-VSVG significantly suppressed tumor growth in xenograft tumor model when compared with control adenovirus that lacks VSV-G epitope. Taken together, these studies demonstrate that the strategy to extend adenovirus tropism may greatly improve utilities of adenovirus for gene therapy application.