사람 정상 중이점막 배양에서 배양기간에 따른 상피세포의 분화

Abstract

[한글]

최근 배양기술의 발달로 중이점막의 계대배양이 성공적으로 이루어지고 있다. 하지만 이러한 계대배양에 있어서 분비세포와는 달리 섬모세포로의 분화는 현재까지 성공되지 못하고 있다. 본 연구의 목적은 계대 배양된 인체중이점막 상피세포 (human middle ear epithelial, HMEEC)를 섬모세포로 분화시킬 수 있는 배양법을 확립하고, 이에 성공한다면 배양 시기별 섬모세포와 분비세포의 구성비율을 확인하고자 하였다. 또한 배양시기별 점액과 리소자임의 분비량 및 그 mRNA의 발현양상을 알아보고자 하였다. 정상적 형태를 보이는 중이점막을 수술 중 채취하여 이를 단일세포로 분리하여 계대배양한다. 계대배양된 세포는 Air-Liquid Interface(ALI) 배양법을 통하여 합류 후 2일, 1주일, 2주일, 3주일, 4주일간 배양한다. 각 배양시키마다 면역형광염색법과 dot-blotting방법을 이용하여 섬모세포와 분비세포의 비율과 점액과 리소자임의 분비량을 측정한다. 또한 Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)을 통하여 점액(MUC5AC, MUC5B, MUC8)과 리소자임 mRNA 의 발현정도를 알아본다. 섬모세포로의 분화는 합류 후 약 16에서 18일 사이에 처음으로 관찰되었다. 이후 섬모세포의 비율은 배양기간에 따라 늘어 합류 후 4주에는 10.6%까지 증가한다. 이에 비하여 분비세포의 비율은 배양초기부터 40% 내외로 뚜렷한 변화를 보이지 않는다. 점액과 리소자임 단백질의 분비량은 합류 후 2주까지는 증가하나 그 이후에는 변화가 없었다. 점액 mRNA의 경우 MUC5B와 MUC8의 경우 배양기간에 따라서 증가하나, MUC5AC의 경우 합류 2주에 가장 발현이 증가하였다가 이후 감소하였다. 이상의 결과에서 연구자는 ALI 배양법을 통하여 계대배양된 인체중이점막상피세포가 섬모세포로 분화 할 수 있음을 확인하였고, 섬모세포로의 분화는 분비세포에 비하여 늦음을 관찰하였다. 이와 더불어 점액유전자중 MUC5B와 MUC8 mRNA는 배양기간에 비례하여 증가함을 알 수 있었다.

[영문]

Recent technical advances permit serial culture of normal human middle ear epithelial (NHMEE) cells. However, the ciliary differentiation of these cells has not been achieved. The purpose of this study was to establish a culture system to differentiate serially cultured NHMEE cells into ciliated cells. If the ciliated cells were to develop, the percentage of ciliated cells and secretory cells throughout the duration of culture would be measured. We also examined the levels of mucin and lysozyme secretion and their mRNAs in a time-dependent manner. Normal appearing human middle ear mucosa was harvested and subcultured after enzymatic disaggregation. These cells were differentiated in air-liquid interface (ALI) culture for 2 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks and 4 weeks after confluence. On each culture period the ratio of ciliated cells and secretory cells and the amount of mucin and lysozyme secreted from the cultured cell were measured by immunohistochemical study and dot blotting. The level of mucin gene 5AC (MUC5AC), MUC5B, MUC8 mRNAs and the level of lysozyme mRNA were measured on each culture periods by reverse transcription(RT)-polymerase chain reaction(PCR).Ciliogenesis usually started on the 16th-18th day after confluence. The percentage of ciliated cells increased over time up to 10.6% but that of secretory cells remained at about 40% throughout culture duration. By the 14th day after confluence, the amounts of mucin and lysozyme secretion increased rapidly and then maintained a plateau. The expression levels of MUC5B, MUC8 and Lysozyme increased with culture time. Especially MUC8 showed the dramatic increase on the 28th day after confluence. In contrast, the level of MUC5AC mRNA showed a peak on the 14th day after confluence, and then decreased. Ciliary differentiation of NHMEE cells can be induced by ALI culture system. Our study also suggests that secretory function develops earlier than ciliogenesis, and that the expressions of MUC5B and MUC8 mRNAs increase as a function of differentiation.