Identification of telomere binding region and ribozyme target site in human telomerase RNA

Abstract

[한글]

Telemerase는 염색체 말단에 있는 telomere를 연장, 유지시켜주는 역전사 효소이다. 사람의 telemere는 TTAGGG서열이 반복된 구조로서 염색체 기능과 구조 유지에 필수적인 역할을 한다. 이러한 telemere는 세포가 분열할 때 마다, DNA polymerase가 가지는 ‘end replication problem‘에 의해 점점 짧아진다. telomere가 일정길이 이상 짧아진 세포는 더 이상 분열하지 못하고 노화나 세포사멸 기전에 의해 제거되어진다. 하지만 정상 체세포와 달리 암세포에서는 telomerase가 과발현됨으로서 끊임없이 성장, 분열하는 불멸화 능력을 획득한다. 따라서 암치료에 있어 telomerase는 효과적이고 암세포 특이적인 표적분자로 제시된다.Telomerase는 크게 두개의 구성요소로 이루어져 있다. 하나는 역전사 효소 기능을 가지는 단백질 부분인 hTERT와 telemere의 주형으로 역할을 하는 RNA인 hTR로 이루어져 있다. hTR은 모든 척추동물에서 잘 보존된 이차 구조를 가지고 있으며 template, pseudoknot, CR4-CR5, Box H/ACA, CR7와 같은 특징적인 구조로 이루어져 있다.본 연구는 hTR이 telomere와 결합하는데 필요한 domain에 대해 알아보고자 하였고, 이것을 바탕으로 하여 이 domain을 억제할 수 있는 ribozyme을 합성하여 항암요법으로서의 가능성을 알아보고자 하였다. 먼저 hTR의 각 domain을 차례로 삭제한 truncation mutant를 제작하였다. 이러한 mutant들이 telomere와 결합하는 능력을 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)로 시행하였다. 결과는 326nt를 가지고 있는 mutant에서부터 결합이 관찰되었다. 따라서 hTR이 telomere와 결합하는데 최소한 326nt가 필수적임을 알 수 있었다. 본 연구자는 이 326nt내에 포함된 있으며 template, pseudoknot, CR4-CR5 domain의 역할을 좀더 알아보고자 각각의 domain에 대한 antisense oligonucleotide를 제작하여 telomere와 결합하는 능력과 효소활성에 미치는 영향을 알아보았다. 결과는 template에 대한 antosense oligonucleotide는 telomere와의 결합과 효소활성을 모두 효과적으로 억제하였다. 반면 CR4-CR5에 대한 antisense oligonucleotide는 효소활성은 효과적으로 억제하였으나 telomere와 결합하는데는 큰 영향을 미치지 못하였다. 이러한 in vitro 결과를 토대로 하여, hTR을 표적으로 하는 7개의 ribozyme을 제작하였다. 7개의 ribozyme을 in vitro에서 합성한 hTR substrate와 반응 시킨 결과 R1 ribozyme에서 효과적으로 hTR이 잘려짐을 관찰하였다. 따라서 R1을 발현하는 expression vector를 제작하여 사람의 유방암 세포주인 MCF-7에 transfection하였다. 이 transfectant로 부터 hTR의 발현이 감소하고 이에 의해 telomerese 효소활성도가 감소되는 것을 관찰하였다. 긍극적으로 이러한 세포에서 R1 ribozyme에 의해 암세포의 성장이 억제됨을 확인하였다.결론적으로 본 실험은 hTR이 telomere와 결합하는데 326nt가 필수적임을 확인하였다. Antisense oligonucleotide 실험을 토대로 각각의 domain은 telomerase가 활성화되는데 서로 다른 기능을 담당하고 있음을 확인하였다. hTR의 template domain을 표적으로 한 R1 라이보자임은 효과적으로 telomerese 활성과 암세포의 성장을 억제하였다. 따라서 hTR의 template domain은 암세포의 telomerase활성을 억제하는 좋은 target site임을 확인하였다.

[영문]

Human telomerase RNA (hTR), an essential component of telomerase, has unique secondary structure consisted of several distinct structural domains as well as template sequence which directs telomeric DNA synthesis at the ends of chromosomes. It is well established that hTR has to be accessible for both telomere and telomerase catalytic subunit (hTERT) for the specialized reverse transcriptase activity of telomerase. Previous studies suggested that only small fragment (159 nucleotides) of hTR is sufficient for the interaction with hTERT, but structural domains of hTR required for interaction with telomere have not been elucidated. Here, we report that at least, the 326 nucleotides fragment of hTR consisted of the template, pseudoknot, and CR4-CR5 domain is required to exhibit a binding capacity with telomere, and simultaneously display a telomerase activity in vitro reconstitution assay. Furthermore, targeted disruption of the template region with antisense oligonucleotide results in the complete blocking of the hTR-telomeric DNA binding, whereas CR4-CR5 disruption totally abrogate telomerase activity in vitro. Since the reactivation of telomerase is thought to be an essential step in immortalization of cells and tumor progression, it is suggested as a good target for anti-cancer strategies. Specific inhibition of telomerase in tumor cells leading to telomere shortening, and eventually, cell death has been demonstrated in recent papers. Ribozyme is a RNA molecule which possesses specific endoribonuclease activity and catalyzes the hydrolysis of specific phosphodiester bonds resulting in the cleavage of the RNA target sequences. Here, we evaluated a target site of hammerhead ribozyme in human telomerase RNA to inhibit telomerase activity. Hammerhead ribozyme targeting the template region of hTR efficiently cleaved human telomerase RNA in vitro. Stable transfectants of ribozyme showed degradation of hTR, and diminished telomerase activity. Moreover, ribozyme transfectants displayed significantly delayed doubling time than parental cells. In conclusion, we demonstrated that hTR interacted with telomeric DNA through a 326 nucleotides of hTR including template, pseudoknot, and CR4-CR5 domains with distinct roles in terms of telomere binding and telomerase activity. The template region of hTR was the best target site for inhibition of telomerase activity, as anticancer strategy using ribozyme in human breast tumor cell.