종양혈관생성에서 내피전구세포의 역할

Abstract

[한글]

기존의 항암약물들은 주로 증식이 빠른 세포를 표적으로 개발되어 왔다. 하지만 정상적으로 빠른 성장을 보이는 조직에 많은 독성을 나타내게 되며 그 효과에도 한계를 보이게 되었다. 종양의 혈관형성에는 angiogenesis뿐만 아니라 내피전구세포에 의한 vasculogenesis도 중요한 역할을 담당함이 제시되었다. 따라서 암 조직 내에서 활발하게 증식하고 있는 종양 내피세포에만 특이하게 억제시킬 경우 암 치료효과는 향상될 것이다. 내피전구세포는 골수에서 유래하며, CD34 양성 단핵구에 존재함이 알려졌다. 내피전구세포의 혈관생성부위로 이동하는 특성을 종양 특이 매개체로 이용하고자 본 연구를 계획하게 되었다. 본 연구에서는 항암약물치료를 시행하는 환자에게 과립구 성장 촉진인자(G-CSF)를 처치하여 백혈구수 증가시켜 말초 혈액에서 CD34 양성 단핵구를 분리 후, basic fibroblast growth factor (bFGF)와 vascular endothelial growth factor (VEGF) 성장인자를 이용한 생체외 배양을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. CD34 양성 단핵구는 생체외 배양 28일경에 cobblestone 형태를 나타내 내피세포의 형태로 분화됨이 확인되었다. 이들 세포는 LDL 섭취반응이 양성으로 나타나 내피세포의 기능을 가지고 있음이 확인되었다.2. CD34 양성 단핵구에서 분화된 세포는 matrigel 배양에서 18∼24시간 경과 후 맥관 형성이 확인되어 이들세포가 신혈관생성에 관여할 수 있음이 확인되었다. 3. CD34 양성 단핵구를 5주 이상 장기간 배양시 분화된 내피세포의 특이적 표지자인 CD31과 P1H12가 발현됨을 확인하였다.4. Realtime PCR을 이용하여 내피세포 연관 유전자 발현 정도를 측정한 결과, IGFBP4, vWF, CTGF, COL6A1, COL18A1, MCAM (Muc 18), VEGFR3/Flt4, CD34, CD105/endoglin, eNOS 발현이 확인되었다.5. CD34 음성이면서 표면 부착성 증식형태를 유지하는 단핵구에서도 같은 성장인자를 이용하여 배양시 일부에서 내피세포의 형태를 관찰할 수 있었다. CD34 음성 단핵구에서 내피세포 형태로 분화된 세포들도 LDL 섭취반응이 양성으로 나타나 내피세포로 분화되고 있음을 확인할 수 있었다. 6. CD34 양성 단핵구에서 내피세포형태로 분화된 세포들은 telomerase 활성이 관찰되어 이들 세포가 순환 성체 세포가 아닌 전구세포 이전 단계임을 제시하였다.7. 마우스에 인체종양을 형성한 동물실험에서 인체의 CD34 양성 말초단핵구에서 유도된 내피전구세포가 혈관을 통한 주입시에 종양조직으로 이동하여 2주 이상 생존하고 있음이 확인되어 종양의 혈관생성과정에 관여함을 확인할 수 있었다.이상의 결과로 말초 혈액에는 내피전구세포가 존재함을 확인할 수 있으며 이들 세포는 CD34 양성 단핵구에서만 아니라 CD34 음성 단핵구에서도 내피세포로 분화됨이 밝혀졌다. 암환자에서 이들 세포를 분리한 후 생체외 증폭, 배양할 경우 이들 세포를 약제 및 치료유전자의 자가 매개체로 응용할 수 있을 것으로 사료된다.

[영문]

Most chemotherapeutic agents in current use have been developed to target cells with a high proliferation rate. However, the role of these agents is limited in that they are also toxic to normal tissue with a high proliferation rate. The therapeutic effect would be improved if they could act specifically on endothelial cells of tumor vessels which are actively proliferating within tumor tissue.It has been suggested that vasculogenesis by endothelial cell precursors as well as angiogenesis play an important role in the production of blood vessels in neoplasms. Endothelial cell precursors arise from the bone marrow and are present in CD34 positive monocytes.The present study was designed in order to utilize the process of migration of endothelial cell precursors to the area of active vessel production as a tumor specific mediator. In patients undergoing chemotherapy, G-CSF was administered and thus mobilization of mononuclear cell was induced. CD34 positive peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were separated from peripheral blood and ex vivo culture using bFGF and VEGF was carried out. The following results were obtained.1. The cells derived from CD34 positive PBMC presented with a cobblestone appearance at 28 days, revealing differentiation into endothelial cells. They were also positive to the LDL uptake reaction, showing that they have biological endothelial cell functions.2. Twenty four hours after culture in matrigel, cells differentiated from CD34 positive PBMC demonstrated tube formation, showing their ability to participate in neovascularization.3. More than 5 weeks after culture, cells derived from CD34 positive PBMC expressed CD31 and P1H12, endothelial cell specific markers.4. The expression of endothelial cell-related genes was evaluated using realtime PCR. IGFBP4, vWF, CTGF, COL6A1, COL18A1, MCAM (Muc18), VEGFR2/Flt4, CD34, CD105/endoglin, eNOS were expressed.5. The morphology of endothelial cells was also observed in adherent CD34 negative cells when cultured with the same growth factors. As these cells were positive to the LDL uptake reaction, it was shown that they are differentiating into endothelial cells.6. The cells derived from CD34 positive PBMC demonstrated telomerase activity, showing that they are more immature than differentiated cells.7. In the experiment with tumor formation in mice, it was shown that endothelial cell precursors derived from CD34 positive PBMC mobilized mainly into tumor area after being injected through tail vein. By isolation and ex vivo amplification of endothelial cell progenitors from cancer patients, we suggest that endothelial cell progenitors maybe used as autologous mediators of chemotherapeutic agents and target genes in targeted cancer therapy.