중추 신경계 해마 세포에서 Zinc에 의한 세포 사멸 시 관여하는 NF-kB 활성화 기전 연구

Abstract

[한글]

Zinc는 많은 단백질의 촉매와 구조에 중요한 구성요소이며 신호 전달자로서 뉴런 활성에 의해 중추 신경 시냅스 부위에서 분비되어지며, 특히 다른 조직에 비해 뉴런에 고농도로 존재한다. 많은 중추 과분극 시냅스에서 과량의 zinc 분비는 뉴런에 유입되면서 신경세포의 사멸을 유발하게 된다. Pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)는 세포 내 zinc의 유입으로 세포사멸 유도 및 전사 조절 단백 NF-κB와 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 활성을 조절한다.

본 연구에서는 태아 흰쥐의 해마에서 유래된 H19-7 신경 세포주에서 PDTC와 zinc의 자극에 대한 NF-κB의 활성 기전, 생존 및 사멸에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려진 MAPK 활성화 기전, 그리고 zinc에 의해 유도되는 protein kinase B (PKB/Akt)의 활성 기능 역할에 대하여 연구하였다. H19-7세포에서 PDTC는 시간 및 농도 의존적으로 세포사멸을 유도하였으며, 세포 사멸 시 NF-κB의 활성화는 PDTC 자극에 의해 증가하였으며, 이러한 NF-κB의 활성도 증가는 세포 내 [Zn2+]i 농도 증가에 의한 세포사멸과 연관되어 있음을 알 수 있었다. PDTC 및 zinc에 의한 신경 세포 사멸 시 IκB kinase (IKK), casein kinase 2 (CK2), phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K), Akt, extracellular signal-regulated kinase (ERK) 와 c-Jun N-terminal kinase (JNK)등과 같은 MAPK,GSK-3β의 활성화 및 β-catenin 단백질 분해가 유도됨을 확인하였다. PI-3K, JNK 또는 CK2 활성 경로의 봉쇄는 zinc 이온에 의한 IKK 활성증가 및 IκB 의 인산화 증가를 뚜렷하게 억제하고 세포사멸 또한 억제한다. 또한

dominant-negative SEK를 H19-7세포에 transfection 시켰을 때, zinc에 의한 Akt 활성화는 억제시키지 못했지만, kinase-inactive Akt의 일시적인 형질전환은 JNK 활성을 봉쇄하여, zinc에 의해 발생하는 신경 세포 사멸 신호전달 과정에서 Akt가 JNK의 윗 부분에 위치한다는 것을 알 수 있었다. 게다가 선택적으로 CK2의 활성을 억제하는 억제제는 zinc에 의해 유발되는 JNK 활성을 억제하였지만, 반면에 JNK 활성 억제는 CK2 활성에 별다른 영향을 주지 못하였다.

위와 같은 결과로 CK2는 zinc 이온에 의한 세포 생존을 직접적으로 조절하며, CK2-JNK 신호전달 기전은 zinc이온에 발생하는 여러 가지 신호전달 기전중 하나라는 것을 알 수 있었다.

이와 더불어 zinc에 의한 세포 사멸 시 Akt의 활성화는 zinc에 의한 세포 생존율 영향에 미침을 알 수 있었다.

특히 Akt 활성을 유도하는 threonin 308 과 serine 473 잔기를 돌연변이 시킨 kinase-inactive Akt 와 PI-3K와 결합을 억제시켜 Akt 활성을 억제시킨 A2-myr-Akt를 일시적으로 형질전환 시키거나 PI-3K 억제제로 알려진 LY294002를 전처치하여 H19-7 세포에서 zinc에 의한 세포생존율 편차를 확인 해 본 결과, zinc에 의한 세포사멸 발생 시 early-phase에서 세포 사멸률의 감소를 보였다. 또한 Akt의 활성화는 GSK-3β 활성화를 유도하였는데, LY294002 및 kinase-deficient Akt에 의해 활성이 억제됨을 볼 수 있어서, GSK-3β의 활성화 기전은 PI-3K/Akt 신호 전달 기전에 의존적으로 작용함을 알 수 있었다. GSK-3β의 활성화는 세포 내에서 순차적으로 Tau의 과인산화와 β-catenin의 분해를 유발하는데, zinc에 의한 H19-7 세포 사멸에서도 시간에 따라 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 Tau 단백의 과인산화 및 β-catenin의 분해는 kinase-deficient GSK-3β를 H19-7 세포에 transfection 시킬 경우, Tau 인산화는 억제하지만, β-catenin 분해는 억제하지 못함으로써, GSK-3β에 의해 Tau는 의존적으로 인산화되며, β-catenin 분해에는 별 다른 영향을 끼치지 않음을 알 수 있었다. 이상의 결과를 요약하면 PDTC는 해마 신경 세포주에서 세포 내로 zinc 이온의 선택적 유입을 통해 세포 사멸을 유도하며 이 과정에 여러 신호 전달의 활성화를 거쳐 전사조절 단백 NF-κB의 활성화를 통해 이루어짐을 알 수 있었다.

[영문]

Pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) was previously shown to induce cell death by the stimulation of intracellular zinc transport and modulation of NF-κB activity. We explored how zinc might modulate intracellular signal transduction pathways. The exposure of PDTC induced a dose-dependent cell death in immortalized hippocampal H19-7 cells. During cell death the activity of NF-κB was induced and it was well correspondent to the increase of intracellular free zinc level. Thus increase subsequently activated various protein kinases, including IκB kinase (IKK), Akt, CK2, and MAPK, such as ERK and JNK, but not

p38 kinase. PDTC-induced IκB phosphorylation was significantly blocked by inhibition of JNK, but not by ERK. While the transfection with dominant-negative SEK did not inhibit Akt activation by zinc, overexpression of kinase-inactive Akt mutants completely blocked the activation of JNK, implying that Akt is present upstream of JNK. The inhibition of JNK and/or Akt did not block PDTC-induced IκB phophorylation completely. Furthermore, selective CK2 inhibitor, DRB, did not affect on PDTC-induced IκB

phosphorylation.

We have also studied the possible role of Akt activity during zinc- and PDTC-induced neuronal cell death.

Treatment of H19-7 cells with PDTC or zinc plus zinc ionophore led to the phosphorylation at Ser473/Thr308 and subsequent its activation in a time-dependent manner. When we examined whether any possible downstream targets of Akt are modulated in response to zinc, it caused the increase of the levels of phosphorylated GSK-3α/β at Ser9/21 as well as Tyr residues, resulting its activation. In addition, the overexpression of kinase-deficient Akt remarkably suppressed the activation of GSK-3β. Furthermore,

the phosphorylation of Tau followed by its cleavage appears to be dependent upon zinc-induced activation of GSK-3β, respectively. Taken together, these data suggest that intracellular zinc may modulate several signaling pathway implicating in neuronal cell death and survival. In addition, Akt and GSK-3β may play

an important role to modulate cell death induced by zinc in CNS hippocampus neuronal cells.