세균 초항원이 말초혈액 단핵구와 대식세포에서 toll-like receptor의 발현에 미치는 영향

Abstract

[한글]

대표적인 세균 초항원(superantigen)인 포도구균 장독소 B (staphylococcal enterotoxin B, SEB)는 독성 쇽 증후군(toxic shock syndrome)과 중증 패혈증을 일으키는 원인 물질로 알려져 있다. 그러나 SEB가 어떤 기전을 통해 면역세포를 활성화 하는지는 명확히 밝혀져 있지 않다. 최근 미생물이나 미생물독소의 특정 구조인 pathogen associated molecular pattern (PAMP)을 인지하는 수용체로 Toll-like receptor (TLR)가 밝혀졌으며, 이는 주로 단핵구계 세포에 많이 분포한다. 사람에는 10개의 TLR가 밝혀져있으며, 이중 TLR2와 TLR4는 각각 그람 양성균의 세포벽 성분과 지질다당질(lipopolysaccharide, LPS)에 의해 활성화되어 신호전달을 촉발하는 수용체로 알려져 있다. 본 연구에서는 세균 초항원에 의한

면역세포 활성에 TLR의 관련성을 알아보기 위해 정제한 SEB로 사람 말초혈액 단핵구와 사람 단핵구 유사 THP-1 세포주, TLR4 돌연변이 C3H/HeJ와 TLR4 정상인 C3H/HeN 마우스의 대식세포을 자극하여

TLR와 염증성 사이토카인 발현의 변화를 역전사중합효소연쇄반응으로 확인하여 다음의 결과를 얻었다.

1. 세균 초항원인 SEB를 dye ligand affinity chromatography법으로 분리 정제하였으며, BALB/c 마우스를 이용한 치사율 실험과 마우스 비장세포를 이용한 3H-thymidine 흡착 실험에서 강력한 초항원

효과가 관찰되었다.

2. 정제된 SEB로 사람 말초혈액 단핵구를 자극하였을 때 TLR1과 TLR5의 mRNA 발현이 점진적으로 상승하였고, TLR4 mRNA의 발현은 SEB 처리 후 1, 2시간째는 발현이 억제되다가 3시간 이후에 상승되는

소견이 관찰되었다.

3. TLR4 mRNA 발현의 변화는 말초혈액 단핵구를 LPS로 자극하였을 때에도 관찰되었고 SEB와 LPS를 동시에 자극하였을 때 더 현저한 변화를 보였다.

4. THP-1 세포주를 SEB나 LPS로 자극하였을 때 TLR2보다는 TLR4의 mRNA 발현에 현저한 변화를 관찰할 수 있었다.

5. TLR4 기능에 결함이 있는 C3H/HeJ 마우스의 대식세포에서는 SEB 자극에 의한 정상적인 TNF-α mRNA 발현의 상승이 관찰되지 않았다.

결론적으로 세균 초항원인 SEB에 의한 말초혈액 단핵구와 대식세포 활성은 TLR4에 의한 신호전달에 의해 매개될 가능성을 발견하였고, SEB와 LPS를 병용 처리 시 TLR4 발현에 상승효과가 있음을 확인하였다.

[영문]

Staphylococcal enterotoxin B (SEB) as a prototype of superantigens is known to play a pivotal role in toxic shock syndrome and severe sepsis. However, the precise mechanisms initiating the activation of innate effector cell by SEB is unclear. Recently, Toll-like receptors (TLRs) as sensor of pathogen associated molecular pattern (PAMP) are abundantly expressed in monocytic lineage-cells.

Specifically, TLR2 and TLR4 were identified as major signaling receptors activated by Gram-positive cell wall components and lipopolysaccharide (LPS), respectively. The purpose of this experiment is whether TLRs would be involved in SEB-induced immune cell activation as well as to prove differentia TLR expression stimulated by SEB and/or LPS. In that context, SEB was purified by dye ligand affinity chromatography and RT-PCR was performed in human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), human monocyte-like THP-1 cell line and TLR4 intact (C3H/HeN) defective (C3H/HeJ) murine macrophages for detection of TLRs and cytokines mRNA.

The results were as follows:

1. The purified SEB produced a single band when subjected to sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, holding potent superantigenic effect in mice.

2. Treatment of PBMC with SEB elicited significant changes in the expression of several TLRs. Interestingly, TLR1 and TLR5 were clearly up-regulated in PBMC, whereas mRNA of TLR4 was down-

regulated in very early period of stimulation (post 1～2 hour), thereafter being up-regulated in after 3 hours.

3. Up-regulation in mRNA of TLR4 was seen in PBMC stimulated by LPS. Such an up-regulation was more prominent through the concomitant exposure to both SEB and LPS.

4. TLR4 mRNA expression in THP-1 cell line stimulated by SEB or LPS was similar to the patterns in PBMC.

5. TLR4 defective murine macrophages failed to exhibit an increase in TNF-α mRNA expression following SEB stimulation compared to TLR4 intact macrophages.

Collectively, this study indicates that SEB might trigger inflammatory signals on macrophages and PBMC via TLRs, particularly TLR4. And combined with LPS, SEB synergistically may modulate TLR signaling.