자연살 세포에 의한 HepG2와 Hep3B 간암세포주의 세포사멸 기전 분석

Abstract

[한글]

자연살 세포(Natural Killer cell)는 종양세포 및 바이러스에 감염된 숙주세포를 제거하는 기능을 하며, 부적절한 골수 이식을 거부하고 사이토카인 분비를 통해 면역반응을 조절하는 등 생체 내 면역방어기전에 중요한 역할을 담당하고 있는 행동 세포(effector cell)이다. 자연살 세포와 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte; CTL)에 대한 다양한 연구를 통해 표적세포에 대해 세포독성능을 보이는 두 가지 주요한 기전이 밝혀졌다. Perforin/granzyme 등의 과립 분비를 통해 세포괴사(necrosis)와 세포고사(apoptosis)를 유도하는 기전과 death receptor/ligand interaction을 통해 세포고사를 유도하는 기전이다. 자연살 세포가 백혈병세포에 대해 탁월한 세포독성능을 보일 뿐만 아니라 폐암, 유방암, 육아종 등의 고형 종양세포에 대해서도 세포독성능을 발휘할 수 있다고 알려져 있는데, 한국형 호발암의 하나인 간암세포에 대한 세포독성 작용은 구체적으로 밝혀진 바가 없었다. 특히 자연살 세포 표면의 세포사멸 (cell death) ligand를 통해 간암세포에서 세포고사가 유도될 수 있는지에 대해서는 알려진 바가 없어 이에 대한 연구가 필요하였다.

본 연구에서 자연살 세포에 의한 간암세포의 세포사멸을 알아보기 위해 51Cr release assay를 수행한 결과, HepG2와 Hep3B 세포는 자연살 세포에 대해서 매우 높은 감수성을 보이는 것으로 나타났고,

JAM test 결과, 자연살 세포가 HepG2 세포의 세포고사는 유도하지 못하지만, Hep3B 세포의 세포고사를 유도하는 것이 관찰되었다. 자연살 세포를 0.5% paraformaldehyde로 고정시켜서 과립 분비를 억제한 후 JAM test를 시행하여, 자연살 세포 표면의 ligand와 Hep3B 세포 표면의 수용체의 작용에 의해서도 Hep3B 세포에서 세포고사가 유도된다 는 것을 확인하고, 자연살 세포에 발현되어 있는 ligand들과

HepG2, Hep3B 세포 표면에 발현되어 있는 수용체들을 유세포 분석과 역전사 중합효소 연쇄 반응으로 조사하였다. 자연살 세포는 세포고사를 유도하는 대표적인 ligand인 FasL를 발현하고 있고, HepG2 세포에서는 FasL의 수용체인 Fas가 발현되어 있으나, Hep3B 세포는 Fas를 발현하지 않았다. HepG2 세포에 agonistic anti-Fas IgM antibody인 CH11을 처리해도 세포사멸이 유도되지 않는다는 보고가 있고, 자연살 세포에 의해서 일어나는 HepG2 세포의 세포사멸이 antagonistic anti-Fas IgG antibody인 ZB4로 억제되지 않는 것을 볼 때, HepG2 세포는 Fas를 발현하고 있긴 하지만 Fas/FasL를 통해서 사멸되지는 않는 것을 확인할 수 있었다. 자연살 세포는 FasL 이외에도 표적세포의 세포고사를 유도할 수 있는 대표적인 ligand로 알려진 TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL)을 발현하고 있었고, HepG2와 Hep3B 세포에서 TRAIL에 대한 수용체인 DR (death receptor)4와 DR5의 전사체가 발현되어 있었다.

HepG2와 Hep3B 세포에 recombinant TRAIL을 처리한 결과, HepG2와 Hep3B 세포에서 세포고사가 유도 되었으며, 특히 Hep3B 세포에서 보다 효과적으로 유도되었다.

이상의 결과로, 자연살 세포가 주로 과립 분비를 통해서 HepG2와 Hep3B 세포의 세포사멸을 유도하고 Fas를 발현하는 HepG2 세포는 자연살 세포의 FasL에 의한 세포사멸에 저항성을 가지며 Fas를 발현하지 않는 Hep3B 세포 에서 관찰되는 세포고사에 자연살 세포의 FasL 외에 TRAIL같은 다른 세포사멸 ligand들이 관여할 가능성이 있음을 알 수 있었다.

본 연구를 통해 얻은 자연살 세포의 간암세포 사멸 기전에 대한 구체적인 정보는 간암의 예방 및 치료법 개발에 유용하게 활용될 수 있는 기초적인 자료가 될 것이다.

[영문]

NK cells play important roles in innate immunity by exhibiting cytotoxicity against cells infected by viruses or bacteria, transplantated cells and neoplastic tumor cells. There are two major pathways in the killing mechanism of NK cells. In one pathway, death receptor on target cells is cross-linked by

effector cell ligand, and it triggers a relatively well-studied death pathway involving caspase activation.

Another pathway involves a polarized secretion of preformed perforin and granzymes by effector cell granule exocytosis, which leads to rapid target caspase activation as well as a caspase-independent death pathway. NK cells display an effect not only in the elimination of leukemia cells but also in that of solid tumors. However, it is not known whether NK cells can kill liver cancer cells which are solid tumors. Particularly, it is not known whether apoptosis of hepatocellular cacinomas can be led

through NK cell surface ligand.

To investigate whether NK cells can kill liver cancer cell lines, two hepatocellular carcinoma cell lines HepG2 and Hep3B were co-cultured with primary human NK cells and NK cell-mediated cytotoxicity was examined using 51Cr release assay. All target cells appeared to be extremely sensitive to the NK cell-mediated cytotoxicity. Whereas, JAM test (3[H]-Thymidine release assay) results showed that NK cells induce apoptotic death of Hep3B only. To explore the possible involvement of Fas in NK cell cytotoxicity against hepatocellular carcinomas cell lines, cell surface Fas expression of HepG2 and Hep3B was investigated. HepG2 expressed Fas on the surface but Hep3B didn’t. Treatment of ZB4 did not block NK-induced morphological change of HepG2. Therefore, it is highly likely that HepG2 is resistant to Fas-mediated cell death. In addition to FasL, NK cells also express

TRAIL, a ligand of death receptor, which is able to lead to apoptosis of target cells. Both HepG2 and Hep3B appeared to express mRNAs of TRAIL receptors (DR4, DR5, DcR1, DcR2). Interestingly, treatment of recombinant TRAIL (rTRAIL) induced more apoptotic death of Hep3B. This suggests that NK cell-induced apoptotic Hep3B death might be mediated by TRAIL on NK cell surface.

The information about the characteristics of the killing mechanism of human NK cells against hepatocellular carcinoma cell lines obtained from this study could be used to design a useful

protocol for prevention or cure of liver cancers.