The effect of recombinant human bone morphogenetic protein-4 on the osteoblastic differentiation of mouse calvarial cells affected by porphyromonas gingivalis

Abstract

[한글]

골 형성 유도 단백질(Bone Morphogenetic Proteins;BMP)에 의한 골 재생 유도 효과는 수많은 연구를 통하여 입증되었지만, 치주 원인 균에 의하여 골 형성 유도 단백질의 골 재생 유도 효과가 변화될 수 있는지는 명확하지 않다. 본 연구의 목적은 대표적 치주 원인 균의 하나인 Porphyromonas gingivalis의 분쇄 추출물로 백서태자 두개골 세포를 전 처리하였을 때 재조합 인간 골 형성 유도 단백질-4(recombinant human BMP-4;rhBMP-4)에 의한 세포의 골성 분화에 미치는 영향을 알아보고자 함이다. 백서태자의 두개골 세포를 무균적으로 분리, 배양하여 단일 층의 밀생 상태가 되면, 1 µg/ml의 분쇄 추출물로 2일간 처리하였다. 세척 후, 세포들을 rhBMP-4(0-100 ng/ml)의 처리하에 3일간 추가적으로 배양하였고, 실험 종료 후 세포들을 수집, 분쇄하여 염기성 인산 효소(alkaline phosphatase ;ALP)의 활성도를 측정하였다. RT-PCR 분석법을 이용하여 ALP mRNA 발현 정도를 측정하였고, 배양액 내로 유리된 prostaglandin E2 (PGE2)의 양을 측정하기 위하여 효소 면역 분석법을 시행하였다.

ALP 활성도는 분쇄 추출물의 처치에 상관없이 rhBMP-4의 농도를 증가시킴에 따라 모든 세포군에서 증가하였다. 그러나 분쇄 추출물을 처치한 세포군에서의 ALP활성도는 처치하지 않은 세포군에 비교하여

rhBMP-4의 모든 농도에서 통계학적으로 유의한 감소를 나타내었다. RT-PCR 방법에 의한 ALP mRNA발현 정도의 분석에서도 유사한 결과가 관찰되었다. 또한, 분쇄 추출물을 처치한 세포군에서 처치하지 않은 세포군에 비교하여 유의하게 많은 양의 PGE2가 유리되었다.

이상의 결과를 볼 때, rhBMP-4는 세포의 골성 분화를 자극시키는 효과를 가지지만, 자극 효과는 P. gingivalis에 의하여 감소될 수 있음을 알 수 있으며 아마도 세포내 PGE2경로 기전이 관여된다고 사료된다. 그러나, 분쇄 추출물을 처치한 세포군에서도 rhBMP-4에 의한 골성 분화 자극 효과가 농도 의존형으로 나타나므로, 치주 원인균에의해 손상된 골 결손부의 골 재생 치료에 보조적 BMP의 처치는 유익한 방법이라 할 수 있겠다.

[영문]

Background: A number of studies have shown effective bone regeneration induced by bone morphogenetic proteins(BMPs), but it is not clear whether the presence of periodontopathic bacteria has any significant modulation effect on the bone regeneration ability of BMPs. The present study examined whether pretreatment of mouse calvarial cells with porphyromonas gingivalis extracts can make a difference in their osteoblastic differentiation exerted by recombinant human bone morphogenetic protein-4 (rhBMP-4).

Methods: Primary mouse calvarial osteoblastic(MCO) cells were cultured until they reached confluence. At confluence, cells were untreated or pretreated with 1 µg/ml of sonicated P.gingivalis extracts(SPEs) for 2 days. After washing, the cells were further incubated in the presence of rhBMP-4(0-100 ng/ml) for 3 days. At the end of the treatment, the cells were harvested and lysed for measurement of the alkaline phosphatase(ALP) activity. Total RNA was extracted and reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) analysis for expression of ALP mRNA was conducted. The amount of prostaglandin E2(PGE2) secreted into the culture supernatant was determined using enzyme immuno assay.

Results: The stimulatory effect of rhBMP-4 on ALP activity was observed in both untreated MCO cells and in cells pretreated with 1 µg/ml of SPEs in a dose-dependent manner. The ALP

activities were significantly reduced in the cells pretreated with SPEs at all concentrations of rhBMP-4 used in this study when compared to cells untreated with SPEs. Similar results were obtained in the RT-PCR analysis for ALP mRNA. Cells pretreated with SPEs released significantly larger amount of PGE2 than untreated cells, but the treatment with 100 ng/ml of rhBMP-4 had no significant effect on the amount of PGE2 released. These results suggest that stimulatory effect of rhBMP-4 on the

osteoblastic differentiation might be significantly reduced by P. gingivalis, possibly through the endogenous PGE2 pathway, but rhBMP-4 still has a stimulatory effect on osteoblastic differentiation of mouse calvarial cells affected by P. gingivalis.