결핵의 혈청진단을 위한 새로운 결핵균 유전자재조합 항원의 생산과 특성 규명

Abstract

[한글]

결핵은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 의하여 유발되는 만성 감염성 질환으로 전 세계적으로 주요한 질병중의 하나이다. 우리나라의 결핵 유병률은 1995년 전국 실태조사에서 1.0%로 약 40만명의 흉부 X-선 검사상 활동성 결핵 환자가 있는 것으로 보고되았다. 최근 여러 나라에서 다제내성 결핵균주의 출현이 증가함에 따라 결핵에 대한 효과적인 백신 개발의 중요성이 부각되고 있다. 효과적인 백신 및 치료제의 개발이 결핵 퇴치 전략의 주요 요인으로 자리잡고 있으며, 특히 현재 사용되는 방법보다 더 신속하고 정확하며 효과적인 새로운 검진 방법의 개발이 필요한 실정이다. 또한, 결핵균의 유전자 지도가 밝혀진 이후로, 결핵의 면역진단 및 백신에 유용한 단백질 항원을 탐색하는 연구가 활발히 진행 되고 있다. 본 연구에서는 현재 상용화되고 있는 주요 결핵균 항원인 Rv3019c (6kDa), Rv2031c (16kDa), Rv0934 (38kDa) 등을 이용한 혈청진단검사보다 우월한 검사법을 개발하는데 필요한 결핵균 항원을 탐색하고자 아직 유용성이 알려지지 않은 Rv3874 (CFP10), Rv0674, Rv3705c, Rv0566c, Rv3369, Rv0469 (UmaA1), Rv3606 (FolK), Rv2534c (Efp) 항원의 혈청진단 유용성을 조사하고자 하였다. 본 연구에서는 SignaIP와 SPScan 프로그램을 이용하여 signal peptide 점수를 산출한 결과 높은 점수를 나타내는 군에서 그 기능이 알려지지 않은 Rv0674, Rv3705c 단백질 유전자를 pET 벡터에 클로닝하고 E. coli에 발현을 시킨뒤, Ni agarose 컬럼을 이용하여 정제하였다. 이와 같이 정제한 단백질과 외부기관에서 정제한 Rv3874 (CFP10), Rv0566c, Rv3369, Rv0469 (UmaA1), Rv3606( FolK), Rv2534c (Efp) 단백질의 생물학적 특성을 SDS-PAGE 분석을 통해 규명하였다.

이들 유전자재조합 단백질들을 대상으로 결핵환자 150여명과 건강대조군 100여명의 혈청에서 ELISA를 이용하여 IgG 항체를 검출하였다. 150명의 결핵 환자 중 148명 (98.6%)의 결핵 환자에서

최소 한 개 이상의 유전자재조합 항원에 대한 항체가 검출되었다. Rv3705c 항원은 결핵 환자의 혈청에서 높은 양성 반응을 보였으나, 건강대조군의 혈청에서도 역시 높은 양성반응을 보여 면역진단으로서의 유용성을 기대하기 어려웠다. Rv0674 항원은 결핵 환자의 혈청과 건강대조군 혈청 모두 낮은 양성 반응을 보여, 역시 면역진단으로서의 가치를 입증 할 수 없었다. Rv0469 (UmaA1), Rv3606 (FolK), Rv2534c (Efp) 항원은 각각 71.3%, 21.3%, 74%의 민감도와 99%, 91%, 85%의 특이도를 보였으며, 특히 Rv0469 (UmaA1) 항원은 민감도와 특이도 모두 만족할 수준을 보여 앞으로 새로운 혈청진단

항원으로서의 가치가 있을 것으로 기대된다.

본 연구에서는 단일 항원의 민감도 저하를 극복하기 위하여 여러 가지 항원을 조합하였는데, Rv0469 (UmaA1) 단독 사용시 71.3%의 민감도가 Rv0934 (38kDa)과 조합할 경우 92.6%, Rv2534c (Efp)와

Rv3369를 함께 조합할 경우 91.3%까지 상승하였다. 반면에, Rv0469 (UmaA1) 항원 단독 사용시 99%였던 특이도가 Rv0934 (38kDa)과 조합할 경우 94%까지 저하된 것을 보아, 민감도를 높일 수 있는 대신 특이도가 다소 떨어졌다. 특이도를 95%이상 유지하며 민감도를 최대한 높일 수 있는 항원의 조합은 Rv0469 (UmaA1) + Rv3874 (CFP10)으로 이때 민감도는 81.3%, 특이도는 97%이었다. 또한, Rv0469

(UmaA1) + Rv0934 (38kDa) 항원 조합의 경우도 민감도가 92.6%, 특이도가 94.0%으로 혈청 검사에 유용할 것으로 생각된다

본 연구 결과는 위에서 제시된 8가지 유전자재조합 단백질중 Rv3874 (CFP10), Rv0566c, Rv3369, Rv0469 (UmaA1), Rv3606 (FolK), Rv2534c (Efp) 6개의 단백질이 결핵균의 단백질 항원에 대한 항체를

찾아내는데 유용하다는 것을 제시하고 있으며, 현재 상용화되고 있는 주요항원과 함께 조합하여 사용할 경우, 민감도를 향상시킬 수 있다는 것을 말해준다. 따라서 본 연구에서 보여준 다양한 결핵균 특이항원의 조합을 통해 ELISA방법을 사용하여 결핵검진을 시행한다면 신속하고 저렴하게 환자의 건강진단에 매우 유용할 것으로 기대된다.

[영문]

Tuberculosis (TB), a chronic infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis, is one of the major public health problems in the world. In Korea, about 1% of population (approximately 400,000 people) was reported to have active TB based on chest X-rays in 1995. The recent increase in

the incidence of TB, particularly multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB), in many countries underscores the need for an effective vaccine against this important disease. Developing effective vaccines and new drugs are among major tuberculosis research activities. Specially, new diagnostic tests (both more rapid and more accurate than currently available approaches) for tuberculosis would be of great value in reducing further transmission of M. tuberculosis by providing opportunity

of treating active TB cases. In addition, after completion of whole genome sequences of M. tuberculosis,extensive efforts to search protein antigens for immunodiagnosis and vaccine for tuberculosis have been made by many researchers. This study was initiated to search for new proteins of M. tuberculosis

for serodiagnostic tests, which are more rapid and accurate than currently serodiagnostic tests.

During the study, recombinant protein antigens such as Rv3874 (CFP10), Rv0674, Rv3705c, Rv0566c, Rv3369, Rv0469 (UmaA1), Rv3606 (FolK), and Rv2534c (Efp) of M. tuberculosis were prepared and

evaluated for use in serodiagnosis of TB. In this study, two open reading frames, Rv0674 and Rv3705c, were initially selected for preparation of recombinant proteins because they contained

signal peptides which were identified with two computer programs, SignaIP and SPScan. These two protein encoding genes were cloned and expressed in E. coli using the pET vector. The expressed

proteins were then purified using a Ni-agarose column. These purified protein antigens were analyzed by SDS-PAGE for their purity and molecular weight. In addition, six recombinant proteins, Rv3874 (CFP10), Rv0566c, Rv3369, Rv0469 (UmaA1), Rv3606 (FolK), and Rv2534c (Efp) were obtained through collaboration with scientists at other institutions and included for the study.

These recombinant proteins were examined for IgG antibodies by ELISA in sera from 150 active tuberculosis patients and 100 healthy controls with no evidence of pulmonary TB by chest X-ray.

Of 150 TB patients, 148 (98.6%) had significant level of IgG antibodies to at least one of these antigens, but IgG seroreactivity to each of the antigens varied markedly among the patients. For examples, although TB patients had high level of IgG antibodies to the recombinant Rv3705C protein,majority of healthy controls also showed high seroreactivity to the protein. On the other hand, IgG seroreactivity to the recombinant Rv0674 protein was relatively low in general in sera from TB

patients as well as from healthy controls. These results, thus, indicated that both Rv3705c and Rv0674 proteins containing signal peptides were not useful for use in serodiagnosis of TB.

Likewise, the recombinant proteins Rv0469 (UmaA1), Rv3606 (FolK), and Rv2534c (Efp) were examined for detecting IgG antibodies in sera from TB patients and healthy controls. When a cut-off criteria for seropositivity was determined by adding two S.D. to the mean absorbance of healthy controls, sensitivity of Rv0469 (UmaA1), Rv3606 (FolK), and Rv2534c (Efp) proteins were 71.3%, 21.3%, and 74%, respectively, and specificity were 99%, 91%, 85%, respectively. Especially, the Rv0469 (UmaA1) protein gave a high-level sensitivity and specificity, indicating that the antigen can be used for a new generation of serodiagnostic test for TB./ In addition, various combination of recombinant proteins were analyzed to look into a possible increase in sensitivity without lowering specificity too much. Since Rv0469 (UmaA1) protein was the most promising as shown above, each combination of proteins included UmaA1 protein. The combination of Rv0469 (UmaA1) and Rv0934 (38kDa) resulted in sensitivity of

92.6% and specificity of 94%, while Rv0469 (UmaA1) + Rv3874( CFP10) gave sensitivity of 81.3% and specificity of 97%. Although combination of Rv0469 (UmaA1) + Rv2534c (Efp) + Rv3369 proteins showed sensitivity of 91.3%, but specificity was substantially lowered to 83.0%. Therefore, combinations of Rv0469 (UmaA1) and Rv0934 (38kDa) or Rv0469 (UmaA1) + Rv3874 (CFP10) seem most promising for use in the serodiagnosis of TB.

In conclusion, this study suggests that Rv3874 (CFP10), Rv0566C, Rv3369, Rv0469 (UmaA1), Rv3606 (FolK), and Rv2534c (Efp) recombinant antigen may be useful for serodiagnostic tests, particularly if these antigens are combined with commercially available antigens. It is thus expected that multi-antigen cocktails will be used in developing rapid and inexpensive serodiagnostic tests of TB near future.