당뇨 백서 사구체 및 고농도 포도당으로 자극한 족세포에서 ZO-1의 변화와 안지오텐신 수용체 차단제의 영향

Abstract

[한글]

당뇨병성 신증은 임상적으로 단백뇨를 보이는 것이 특징적인 소견으로, 단백뇨의 발생 기전은 사구체 기저막의 전하 선택성 (charge selectivity)과 족세포 (podocyte)의 크기 선택성 (size selectivity)에 이상이 생겨 발생되는 것으로 알려져 있다. 이중 크기 선택성은 주로 족세포의 족돌기 (foot process) 사이의 slit에 의해 유지되는데, slit 내에 존재하는 세극막 (slit diaphragm)은 nephrin과 p-cadherin 등으로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다. Zonula occludens-1 (ZO-1)은 족세포의 족돌기 세포질 내에

존재하는 단백으로 세극막이 부착되는 부위에 존재하기 때문에 사구체 여과 장벽 (glomerular filtration barrier)의 유지에 중요할 것으로 생각되고 있다. 최근에 단백뇨를 동반한 MWF rat model에서 사구체 내 ZO-1의 발현이 감소되었을 뿐만 아니라 세포 내 분포가 변화되었다는

보고는 있지만, 당뇨병성 신증에서 ZO-1의 변화를 관찰한 연구는 없는 실정이다. 한편 당뇨병성 신증에서 레닌-안지오텐신계의 억제는 단백뇨를 감소시키고 신부전의 진행을 지연시킨다는 사실이 널리 알려져 있으며, 이러한 효과가 혈역학적 기전 이외의 추가적 기전에 의한 것일 수도 있다고 주장되고 있다. 이에 본 연구자 등은 고농도 포도당으로 자극한 조건적 불멸화 족세포 (conditionally immortalized mouse podocyte)에서 ZO-1의 발현을 관찰하였으며, 동시에 streptozotocin으로 당뇨를 유발시킨 백서에서 분리한 사구체에서 ZO-1 mRNA와 단백의 변화도 RT-PCR과 Western blot을 이용하여 관찰하고, 이를 면역조직화학 염색을 통해 확인하였다. 또한 고농도 포도당으로 자극한 족세포와 당뇨 백서에 안지오텐신 제 1형 수용체 차단제 (angiotensin II type 1 receptor blocker, ARB)인 L-158,809를 투여한 후의 변화를 연구하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 7일간 고농도 포도당 (30mM) 배양액으로 배양한 족세포 내의 ZO-1 mRNA와 단백 발현은 정상 포도당 (5.6 mM)으로 배양한 족세포에 비하여 각각 283%와 220% 증가되었으며 (p<0.01), ARB를 투여한 고농도 포도당 배양액으로 배양한 족세포에서는 고농도 포도당군에서 관찰된 ZO-1 mRNA와 단백 발현의 증가가 의의있게 억제되었다 (p<0.05).

2. 24시간 뇨단백 배설량은 당뇨군에서 1개월 후 78.7±7.2mg, 2개월 후 72.8±7.2mg, 그리고 3개월 후 90.6±11.3mg으로, 대조군의 1개월 후 23.0±1.5mg,2개월 후 23.9±1.2mg, 및 3개월 후 19.8±3.2mg에

비해 의의있게 증가되었으며 (p<0.01), 이러한 증가는ARB의 투여에 의해 1개월 후 56.3±6.0mg, 2개월 후 52.5±3.6mg, 및 3개월 후 51.6±6.6mg로 의의있게 억제되었다 (p<0.05).

3. 당뇨군에서 사구체 내 ZO-1 mRNA 및 단백 발현은 대조군에 비해 모든 기간에서 의의있게 증가되었으며, 특히 3개월 후에는 각각 234%와 216% 증가되었고 (p<0.01), 이러한 증가는 ARB의투여로 의미있게 감소하였다 (p<0.05)./4. 면역조직화학 검사상 당뇨군의 사구체에서 대조군에 비해 ZO-1 단백의 발현이 의의있게 증가되었으며, ARB 투여군에서는 당뇨군에 비해 의의있게 억제되었다. 이러한 ZO-1 발현의 변화는 주로 족세포에서 관찰되었다.

이상의 결과로 고농도 포도당으로 자극한 족세포와 당뇨 백서 사구체에서 ZO-1 mRNA와 단백의 발현이 증가한다는 사실을 관찰하였고, 이러한 변화가 ARB의 투여로 억제됨을 처음으로 증명하였다.

또한 당뇨 백서에서 동반되는 단백뇨가 ARB의 투여로 의미있게 감소함을 확인하였다. 결론적으로, 족세포 내의 ZO-1 발현의 변화가 당뇨병성 신증의 초기부터 나타나며, 이러한 변화는 단백뇨의 발생과 밀접한 연관성이 있을 것으로 생각된다.

[영문]

Background : Diabetic nephropathy (DN) is clinically characterized by persistent proteinuria. The underlying pathologic changes responsible for the nephropathy are the loss of size-selective and/or charge selective properties of the glomerular filtration barrier. Size-selectivity is maintained primarily by the slit diaphragm and ZO-1 is one of the basic components of it. However, the precise role of the ZO-1 in the pathogenesis of the glomerular diseases is not fully understood. We investigated the changes of ZO-1 expression in diabetic glomeruli in vivo, and by high glucose in cultured podocyte

in vitro. We also evaluated the effect of angiotensin II type 1 receptor blocker (ARB) on the ZO-1 changes induced by diabetes or high glucose.

Methods : To determine the effect of ARB on podocytes ZO-1 protein and mRNA expression, immortalized mouse podocytes were incubated with RPMI medium containing normal glucose (NG, 5.6mM) or high glucose (HG, 30mM) with or without ARB (10-6M, L-158,809). For animal studies, rats were injected with diluent (Control, C, n=18) or streptozotocin. The latter were left untreated (DM, n=18) or treated with 1 mg/kg/day ARB (DM+ARB, n=18). Four rats from each group were sacrificed monthly, and Western blot and RT-PCR were performed for ZO-1 with sieved glomeruli.

Renal sections were stained for ZO-1 by immunohistochemistry.

Results :

1. The ZO-1 mRNA and protein expressions in podocytes exposed to HG conditions were significantly higher than those of podocytes in NG media (p<0.05). ARB treatment in podocytes under HG inhibited the increment in ZO-1 mRNA and protein expression by 73% and 64%, respectively (p<0.05).

2. Compared to the C rats (19.8±3.2 mg/day), 24-hour urinary protein excretion at 3-month was significantly higher in the DM rats (90.6±11.3 mg/day, p<0.05), and ARB treatment partly reversed the increase in proteinuria in DM rats (51.6±6.6 mg/day, p<0.05).

3. Glomerular ZO-1 mRNA and protein expressions were also significantly increased in DM than corresponding C at all duration (p<0.05). ARB treatment in DM rats for 3 months inhibited the increase in ZO-1 mRNA and protein expression by 57.5% and 70.6%, respectively (p<0.05).

4. ARB treatment for 3 months significantly ameliorated increased glomerular ZO-1 expression in DM rats as assessed by immunohistochemistry.

Conclusion : In conclusion, ZO-1 mRNA and protein expressions were increased in podocytes exposed to HG and in DM glomeruli, and this increment in ZO-1 expression was ameliorated with ARB. Taken together, these data suggest that change of ZO-1 expression in podocytes is implicated in the early changes of diabetic nephropathy and may contribute to the development of proteinuria.