중증 혈우병 A 환자에서 Long-PCR 법을 이용한 Intron 22 역위 탐색

Abstract

[한글]

FVIII 응고 인자의 유전자 결함에 의해 발생되는 혈우병 A는 X 염색체 열성으로 유전되며, 발병 빈도는 약 5,000명의 출생 남아 중 1명 정도이다. 혈우병 A는 임상적으로 FVIII 응고 인자의 활성도 저하 정도에 따라 경증, 중등도, 중증으로 구분되며 이는 유전자 변이의 차이에 기인하는 것으로 알려져 있다. 이 중에서도 중증 혈우병 A는 FVIII 응고 인자의 활성도가 1% 이하의 경우를 의미한다. 외국의 경우 이러한 중증 환자의 상당수에서 유전자 내 intron 22 부위의 역위가 관찰되는 것으로 보고된 바 있다. 그러나 실제 역위 분석에 대한 유전자 검사가 용이하지 않아 국내에서는 이에 대한 보고가 많지 않은 실정이다.

이에 본 연구에서는 비교적 긴 크기의 DNA 증폭을 목적으로 하는 long-PCR 법을 시도하여 중증 혈우병 A 환자에서 intron22 역위에 대한 유전적 결함을 밝힘으로써 향후 유전적 가계는 물론, 산발적 가계에서 보인자 진단, 및 산전 진단 등 유전 상담을 위한 기본 자료를 마련하고자 하였다.

본 연구를 위하여 연세의료원 및 한국혈우재단에 등록된 중증의 혈우병 A 환자 32예를 대상으로 하였다. 말초혈액으로부터 DNA를 추출하고, FVIII 응고 인자 유전자의 intron 22 자체 및 상동 부위에 위치하는 P, Q, A 및 B의 네 종류 시발체를 사용하여 Liu 등의 방법(1998)을 따라 PCR을 시행하였다. PCR 반응 산물을 0.6% agarose gel에서 100V로 전기영동 후 ethidium bromide 염색하여 UV transilluminator로 관찰 후 사진 촬영하였다. 실험결과, PQ, AB 시발체에 의한 12 kb, 10 kb의 반응 산물이 보이면 정상, PB+AQ, AB

시발체에 의한 11kb, 10 kb의 반응 산물이 보이면 역위를 가지고 있는 것으로 판정하였다. 또한 정상인 경우에는 A, B 시발체에 의해 Int22h2 또는 Int22h3의 증폭된 DNA (10 kb) 양이 P, Q 시발체에 의해 Int22h1의 증폭된 DNA (12 kb) 양에 비해 두 배 정도로 강하게 나타나는 반면, 역위인 경우에는 이와 반대로 PB+AQ에 의해 증폭된 DNA (11 kb) 양이 나머지 역위가 없는 부위의 증폭된 DNA (10kb) 보다 두 배 정도의 강도를 보이고 있음에 착안하였다.

그 결과, 중증의 혈우병 A 환자 총 32예 중 10예(31.3%)에서 역위에 대한 양성 결과를 보였다. Long-PCR을 이용한 역위 분석법은 전통적인 Southern blotting법에 비해 간편하며 비교적 빠른 시간에 직접적으로 변이를 검출할 수 있는 방법이므로, 중증 혈우병 A 환자뿐만 아니라 그 가족들을 대상으로 보인자 및 산전 진단에도 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

[영문]

Hemophilia A, characterized by defects in the gene for coagulation factor VIII, is inherited with X linked recessive pattern, and occurs one per every 5,000 male. Hemophilia A is clinically classified as mild, moderate or severe cases depending

on the level of FVIII activity. The level of FVIII activity in the severe hemophilia A is less than 1 percent of the normal level. Inversion at intron 22 of FVIII gene was reported in about half cases of severe hemophilia A. But, only a few study has been reported in Korea probably due to technical difficulties.

In this study, detection of inversion at intron 22 of VIII gene using long-PCR method was performed in order to provide a positive incidence for the detection of carrier state and prenatal diagnosis of hemophilia A.

The subjects were 32 severe hemophilia A patients registered in Yonsei University Medical College or Korean Hemophilia Foundation. DNA was obtained from peripheral blood and PCR was performed using primers P, Q, A and B matching sequences located

in intron 22 and its homologs. PCR products were subjected to 0.6% agarose gel electrophoresis and stained with ethidium bromide. DNA bands were observed and photographed using UV transilluminator.

DNA bands with 12kb and 10kb were detected in normal subjects when PCR was performed using PQ and AB primers, and DNA bands with 11kb and 10kb were detected in patients with severe hemophilia A. In normal cases primer A, B relevant products of Int22h2 or Int22h3 (10kb) were about as twice amount as the primer P, Q relevant products (12kb) of Int22h1. However, in cases with inversion, PB+AQ amplified products (11kb) showed about as twice amount as the products (10kb) amplified in the remaining region. Ten (31.3%) of the 32 patients with hemophilia A showed inversion of intron 22 in this study.

A long-PCR method is simple and rapid for the detection of inversion in the factor VIII gene, as compared to the conventional Southern blotting technique, and may be applicable for the prenatal diagnosis or carrier detection in hemophilia A

families.