생분해성 고분자 지지체의 조성과 세포밀도에 따른 사람 간엽 줄기 세포의 골 형성 유도

Abstract

[한글]

간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 뼈, 연골, 근육, 지방세포 등으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있어, 이들을 이용하여 골 결손부위를 재생하려는 노력이 이루어지고 있다. 이에 있어 적절한 지지체와 결합된 간엽 줄기 세포는 골조직 재생에 적합

한 양식이 될 것이다. Poly-DL-lactic-co-glycolic acid (PLGA)는 생체 적합성이 우수하고 가공성이 뛰어나 간엽 줄기 세포의 적절한 지지체로 사용되어 왔다. 따라서 본 연구에서는 발포성 염과 혼합하여 제조된 삼차원의 다공성 고분자 지지체를 이용하여 간엽 줄기 세포로부터 골세포를 분화 유도하고자 하였다.

연구 재료로는 간엽 줄기 세포를 사람 장골능에서 채취하여 일차 배양 후 사용하였고, 다공성 고분자 지지체는 lactic acid과 glycolic acid의 비율을 달리한 두 종류의 PLGA(65/35, 85/15)와 PLLA(poly-L-lactic acid)를 사용하였다. 배양 2주, 4주, 6주 후에 배양 조직을 10% 포르말린으로 고정, 파라핀에 포매하여 이들을 각각 H/E, Masson''s trichrome, Von kossa 염색을 하였고 osteocalcin에 대하여 면역조직화학 염색과 글루타알데하이드로 고정하여 투과 및 주사전자현미경으로 분화과정을 관찰하였다. 결과는 다음과 같다.

1. 간엽 줄기 세포를 6주간 배양하여 세포외 기질 침착 정도를 PLGA 조성별로 비 교한 결과, PLGA 65/35에서 세포외 기질이 전체 부피의 23%, PLGA 85/15는 21% 였고 PLLA에서 13%로 가장 낮았다(p=0.0066).

2. 간엽 줄기 세포를 PLGA 65/35에 배양하여 주사 전자 현미경으로 관찰한 결과, 지지체 표면에 간엽 줄기 세포 부착과 세포외 기질 형성을 볼 수 있었고 투과 전자 현미경에서 2주에 골세포로의 분화를 확인할 수 있었다.

3. 간엽 줄기 세포를 PLGA 65/35에 배양하여 칼슘 침착 정량 분석 결과, 4주에 칼 슘의 양이 급격히 증가하였다.(p=0.0166)

4. PLGA 65/35 지지체를 이용하여 낮은 세포 밀도(1x106/236mm3)와 높은 세포 밀 도(2.5x106/236mm3)를 비교한 결과, 세포외 기질 형성 정도는 유사하였다. Von Kossa 염색 결과 2주에는 높은 세포 밀도에서 석화화 물질 침착이 더욱 뚜렷하 였으나 6주에는 세포 밀도에 따른 차이를 볼 수 없었다.

이러한 연구 결과로 보아 다양한 조성의 고분자 지지체에서 모두 골세포로 분화하는 것을 확인할 수 있었으며 지지체의 조성에 따라 세포외 기질의 침착 정도가 차이가 있는 것을 관찰하였고 높은 세포 밀도가 석회화에 보다 적합한 조건임을 알 수 있었다. 따라서 발포성 염으로 제조된 다공성 PLGA 지지체에서 배양된 간엽 줄기 세포가 골 조직 개발을 위한 좋은 생체 외 모델로 생각되었으며 향후 동물실험을 진행하여 골 조직 재생을 위한 유용성을 검토해야할 것으로 생각되었다.

[영문]

Mesenchymal stem cells(MSCs) are pluripotent progenitor cells that differentiate into a variety of cells such as osteoblasts, chondroblasts, adipocytes and myoblasts under their appropriate microenvironment. Their ability of selectively inducing mature mesenchymal cells might lead to the recent development of tissue

engineering field to produce human skeletal tissue. The application of scaffold has been required to reconstruct skeletal tissue in vitro. Poly-DL-lactic-co-glycolic acid(PLGA) has been used as scaffold for tissue engineering because its biocompatibility and mechanical adaptability. In this study, we aimed to induce osteogenic differentiation of MSCs using PLGA scaffolds fabricated by gas forming salts as a porogen additives.

Human MSCs were obtained from surgical specimen and cultured in monolayer. The cultured cells were seeded on highly porous PLGA(65/35, 85/15) and PLLA(L-lactic acid) and cultured with osteogenic supplement for 6 weeks. After 2, 4, 6weeks, cell-polymer constructs were fixed with 10% formalin, embedded in paraffin, and sections were stained with H&E and Von kossa. Immunohistochemical staining was performed to detect osteocalcin. And the constructs were fixed with glutaldehyde and were examined by scanning and transmission electron microscopy.

1. As corresponding the amount of extracellular matrix produced by MSCs cultured in three types of scaffolds, PLGA 65/35(about 23% of the whole volume) has the highest capability to produce ECM compared to PLGA 85/15(about 21%) and PLLA(about 13%)(p=0.0066).

2. PLGA 65/35 induced the osteoblastic differentiation of MSCs and deposition of ECM with calcification at 2 weeks.

3. The amount of calcium deposits on PLGA 65/35 was dramatically increased at 4 weeks(p=0.0166).

4. As comparing low seeding density(1x106/polymer) with high seeding density(2.5x106/polymer) on 65/35 PLGA, the calcium deposits reached to the same level on both cell density at 6 weeks.

From these results, we successfully induced osteoblastic differentiation on PLGA and PLLA, PLGA 65/35 cultured with high seeding density was the best in vitro condition. These results suggested that MSCs culture on PLGA scaffolds prepared by gas foaming of efferverscent salts are the useful in vitro model for the osteogenic tissue development.