Staurosporine으로 유도된 세포고사에서 세포내 칼슘이온의 증가기전

Abstract

[한글]

세포의 발생과 분화 및 노화 과정에서 많은 세포들이 세포고사 (Apoptosis)라는 자연적인 세포사멸과정에 의해 제거된다. 세포고사는 포유동물의 세포발생과정에서 필수적으로 나타나는 현상 중의 하나로서 세포질의 축소와 핵질의 응축, 그리고 DNA 분절의 특징을 보이며 caspase의 활성화, 미토콘드리아 기능의 비정상화라는 생화학적인 현상을 수반한다. 그러나, 세포의 분화 및 발생과정에서 뿐만 아니라 질병이나 방사선 조사, 화학물질 등에 의해서도 세포고사의 특징적인 현상들이 나타나는 것으로 밝혀져 세포고사의 원인 및 발생기전 나아가 세포고사를 방지할 수 있는 약물의 개발에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

세포고사에 관여하는 세포내 신호전달과정에는 여러 가지 신호전달 물질 및 효소들이 관여하는 것으로 알려져 있다. c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 그리고 extracellular signal-regulated kinase (ERK)와 같은 MAPK family 및 caspase family 등이 세포고사 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 그 역할이 비교적 잘 알려져 있으나, 근래에는 칼슘 항상성의 상실도 세포 고사를 유발하는 요인으로 생각하고 있다. 세포내 유리 칼슘 (ionized calcium, Ca2+)은 세포내 기능을 다양하게 조절하는 신호전달체계의 매개체로서 세포의 발생, 분화, 성장 뿐 아니라 근육의 수축, 분비선으로부터의 분비, 배움과 기억 등에 관여하는 중요한 세포내 신호전달물질이지만 세포내 칼슘이 오랫동안 고농도로 유지되면 세포에 손상을 주며 세포고사를 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 세포고사를 유발하는 대표적인 약물인 staurosporine을 사용하여 신경세포의 세포고사 과정에서 세포내 칼슘증가가 중요한 역할을 할 것이라는 가정 하에 실험을 진행하였다. Nerve growth factor (NGF)를 이용하여 신경세포로 분화시킨 PC12 세포에 200 nM staurosporine을 투여하면 농도와 시간에 비례하여 세포 생존율이 감소하였는데 이 때 DNA의 분절현상과 caspase-3의 활성화가 관찰됨에 따라 이러한 세포 생존율 감소가 세포고사에 의한 것임을 확인하였다. 분화된 PC12 세포에 fura-2를 축적시키고 200 nM staurosporine을 투여하면서 세포내 칼슘농도를 측정한 결과 세포내 칼슘농도가 140 ± 24 nM 증가하였는데 세포외부에 칼슘을 제거한 경우 세포내 칼슘의 증가 속도와 양이 감소하였으나 아직도 칼슘이 74 ± 16 nM 증가하여 staurosporine이 세포 외부와 내부에서 칼슘을 동원하는 것을 확인하였다. 또한 세포외부의 칼슘을 제거하면 세포생존율이 26%에서 42%로 증가하였고 세포내부의 칼슘을 제거한 후에는 세포생존율이 54%로 증가하여 세포 외부로부터 유입되는 칼슘과 내부에서 유리되는 칼슘 모두 세포고사에 관여함을 확인하였다. 세포내부에서 유리되는 칼슘이 소포체에서 유리되는지 또는 다른 소기관에서 유리되는지 확인하기 위해 우선 세포외부의 칼슘을 제거하고 ionomycin을 이용해 소포체 및 미토콘드리아에서 칼슘을 제거한 후 staurosporine을 투여하여도 세포내 칼슘이 증가되고, ionomycin과 monensin을 동시에 투여한 후에 staurosporine을 투여하면 칼슘이 증가되지 않아 staurosporine이 내부가 산성인 소기관, 즉 분비과립에서 칼슘을 유리함을 확인하였다. Confocal laser scanning microscope을 이용하여 미토콘드리아 내부의 칼슘이 staurosporine에 의해 증가함을 확인하여 staurosporine이 미토콘드리아에서 칼슘을 유리 하는 것이 아니라 세포질 내 증가한 칼슘이 미토콘드리아 내부로 유입되는 것을 확인하였다.

이상의 실험을 통해 신경세포로 분화된 PC12 세포에서 staurosporine에 의해 세포고사가 일어날 때 세포내 칼슘증가가 관여하며 이때 칼슘의 일부는 세포외부에서 유입되며 나머지는 세포내부 특히 분비과립에서 유리됨을 확인하였다.

[영문]

Apoptosis is an intrinsic cellular suicidal program activated during normal physiological process involved in the development of the nervous system. It is characterized by cell shrinkage, membrane blebbing and nuclear DNA condensation and fragmentation, and is accompanied by an activation of caspase family and an abnormal mitochondrial function. However, apoptotic pathways are also known to be activated by various neurodegenerative diseases, chemicals and irradiation.

Many signaling components and enzymes, such as MAPK family and caspases, are known to be involved in the process of apoptosis. Recently, disruption of cellular Ca2+ homeostasis has been proposed to be a critical event in apoptosis. Ca2+ plays a pivotal role in the regulation of a diverse range of cellular functions such as muscle contraction, secretion, synaptic plasticity, cell proliferation, but it also causes cell death if its increase is sustained. Therefore, in this study, I investigated the role of intracellular Ca2+ increase ([Ca2+]i) in neuronal cell death using staurosporine in neuronally differenctiated PC12 cells induced by nerve growth factor (NGF).

Exposure of differentiated PC12 cells to 200 nM staurosporine caused cell death in concentration- and time-dependent manner. It resulted in DNA fragmentation and an activation of caspase-3, suggesting that staurosporine caused apoptosis. Addition of 200 nM staurosporine to the fura-2 loaded PC12 cells induced an increase in [Ca2+]i by 140 ± 24 nM. Removal of extracellular Ca2+ decreased the size of staurosporine-induced [Ca2+]i increase but it still caused [Ca2+]i to increase by 74 ± 16 nM, indicating that staurosporine mobilized Ca2+ from both extracellular space and intracellular Ca2+ stores. The chelation of extracellular and intracellular Ca2+ increased the cell survival from 26% to 42% and to 54%, respectively, which suggested that Ca2+ mobilized from both sources was involved in cell death. To identify which subcellular compartments were responsible for the staurosporine- induced Ca2+ release, cells were stimulated with staurosporine after ER and mitochondrial Ca2+ was depleted by ionomycin in the absence of extracellular

Ca2+. Even after the depletion of ER and mitochondria, staurosporine still induced [Ca2+]i increase suggesting that the Ca2+ source was ionomycin-insensitive acidic compartment in the cells. This was supported by the next experiment in which monensin, a Na+/H+ exchanger, increased [Ca2+]i in the presence of ionomycin. In addition to this, stuarosporine did not increase [Ca2+]i after Ca2+ was removed from the acidic compartment by the pretreatment with ionomycin and monensin. Direct measurement of intra-mitochondrial Ca2+ concentration in rhod-2 loaded PC12 cells using confocal laser scanning microscope revealed that staurosporine increased Ca2+ concentration in mitochondria probably due to the passive uptake of Ca2+ from cytosol.

In conclusion, [Ca2+]i increase plays an important role in staurosporine-induced apoptosis in neuronally differentiated PC12 cells and the main sources of Ca2+ are Ca2+ influx from extracellular space and Ca2+ release from intracellular acidic compartments such as secretory granules and vesicles.