사람 정상 코점막 상피세포에서 배양기간에 따른 분비 및 섬모세포로의 분화

Abstract

[한글]

호흡기 상피세포를 배양함에 있어 배양기간에 따라 세포의 분화정도, 세포의 형태, 점액유전자의 발현양상이 다를 수 있으므로 연구목적에 따라 적절한 처치시기를 결정하기 위해서는 이를 아는 것이 중요하다. 본 연구는 사람 정상 코점막 상피세포를 배양하여 섬모세포로 분화하는가를 알아보고 만약 섬모세포로 분화한다면 배양기간에 따라 섬모세포와 분비세포의 구성비율이 어떻게 변하는지를 알아보고자 하였으며, 또한 배양기간에 따른 점액과 리소자임의 분비량과 그 유전자의 발현을 알아보고자 하였다. 사람 정상 코점막을 계대배양하여 연구하기에 충분한 passage-2 cell을 얻은 후 이의 분화를 유도하기 위하여 air-liquid interface법으로 장기간 배양하였으며 합류를 이룬 후 2일, 1주, 2주, 4주에 배양된 세포의 형태학적 관찰 및 면역조직화학적 염색을 시행하였고, 각 배양시기마다 배양된 세포의 상층에서 24시간 동안 분비된 분비물을 채취하여 점액과 리소자임의 양을 immunoblotting으로 정량하였으며, 각 배양시기별로 세포에서 추출한 mRNA를 RT-PCR을 이용하여 발현시켰다.

섬모세포는 합류 후 2일째에는 관찰되지 않았고, 1주부터 관찰할 수 있었으며 배양기간별 구성비율은 1주에 3.1±0.2%, 2주에 7.4±0.5%, 4주에 14.5±0.6%로 배양기간이 길어질수록 증가하는 양상을 보였다. 분비세포는 합류 후 2일째에 35.6±2.8%, 1주에 32.8±7.8%, 2주에 32.8±2.5%, 4주에 49.4±1.4%의 구성비를 보였으며 2주까지는 배양기간에 따라 큰 차이를 보이지 않았으나 4주째에 약간 증가하였다. 각 배양기간별로 채취한 점액의 분비량은 합류 2일째에는 69.0±9.7μg/106 cells, 1주째에 147.1±12.4μg/ 106 cells,

2주째에 473.0±36.8μg/106 cells, 4주째에 459.5±62.2μg/106 cells로 합류를 이룬 후 2주째에 급격히 증가하는 양상을 보이다가 이후에는 큰 변화를 보이지 않았다. 리소자임의 분비량은 합류 2일째에 122.3±17.2μg/106 cells, 1주에 286.6±19.8μg/106 cells

, 2주에 342.6±25.6μg/106 cells, 4주에 684.2±53.4μg/106 cells로 배양기간에 따라 계속 증가하는 양상을 보였다. RT-PCR을 통해 알아본 점액과 리소자임 mRNA발현을 알아본 결과 합류 1, 2주째는 MUC5AC와 MUC5B mRNA가 주로 발현되었으며 상대적으로 MUC8과 리소자임 mRNA의 발현은 약한 반면, 합류 4주째에는 MUC5AC mRNA의 발현이 약해지며 MUC5B, MUC8, 리소자임 mRNA의 발현이 증가하는 양상이었다./ 결론적으로 사람 코점막 상피세포를 배양함에 있어 배양기간에 따라 다른 특성을 보이므로 연구목적에 따라 처치의 시기가 달라져야 함을 알 수 있으며 충분히 분화된 사람 코점막 상피세포에서 MUC5B와 MUC8 유전자가 점액분비에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.

[영문]

It is important to know the state of differentiation, cell phenotype, and expression of genes for mucus production at the time of study because these may be different at different times during the culture period. The primary purpose of this study was to determine whether the number of the ciliated cells increases as a function of differentiation in NHNE cells. If we observed that there was an increase in the number of ciliated cells, we determined the composition ratio of ciliated cells and secretory cells according to the culture duration. We also examined the levels of mucin and lysozyme secretion, and their gene expression at the same time. The presence of ciliated cells was not evident up to 2 days after confluence. However, 3.1±0.2%, 7.4±0.5% and 14.5±0.6% of the cells were ciliated on the 7th, the 14th and the 28th day after confluence respectively. Meanwhile, the

percentage of secretory cells were 35.6±2.8%, 32.8±2.5%, 32.8±2.5%, and 49.4±1.4% on the 2nd, the 7th, 14th and 28th day after confluence. The amount of secreted mucin showed an abruptly increasing pattern by the 14th day after confluence, but showed no significant changes thereafter. The amount of secreted

lysozyme increased as a function of differentiation. MUC5AC and MUC5B mRNA were mainly expressed between the 7th and the 14th day after confluence with relatively weak MUC8 and lysozyme expression. However, as the MUC5AC mRNA expression became weaker, MUC5B, MUC8 and lysozyme mRNA expression became stronger by the 28th day after confluence. In conclusion, we speculate that in in vitro studies with NHNE cells, the time point of treatment should vary according to the purpose of the study. In addition, the MUC5B and MUC8 gene may play an important role in mucin secretion in fully differentiated human nasal epithelial cells.