H19-7세포주에서 etoposide에 의한 세포사멸시 immeidate early gene cyr61의 발현경로

Abstract

[한글]

cyr61은 serum, bFGF, 또는 PDGF 같은 여러 성장 인자들에 의해서 수분 내에 일시적으로 발현되는 immediate early gene (IEG) 중의 하나이다. Cyr61 단백은 세포 밖으로 분비되어 extracellular matrix와 결합하며, 세포 부착, 이동, 그리고 혈관형성에 관여한다고

알려져 있다. cyr61 promoter의 –2 kb 위쪽에는 전사 조절 인자인 Serum Response Factor (SRF)가 결합하는 Serum Response Element (SRE) motif가 존재하는데 여러 mitogen에 의한 cyr61 전사에 SRE 부위가 중추적인 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. cyr61과 유사하게 mitogen 자극에 의해 빠르고 일시적으로 전사되는 c-fos의 경우 그것의 promoter에 SRE가 존재하고 여기에 결합하는 SRF는 MAP kinase superfamily 중 세포 생존 및 사멸 신호를 매개하는 것으로 알려진 p38 kinase의 하위에 존재하는 MAPKAP kinase 2에 의해 인산화 되는 것이 최근 알려졌다. 세포 사멸 유도는 JNK나 p38 kinase의 활성화에 상관없이 이루어 진다는 몇몇 보고가 있지만, JNK나 p38 kinase의 활성화가 세포 사멸 시 활성화되는 것으로 많이 보고 되었다. 이러한 사실들을 바탕으로 하여 IEG cyr61이 etoposide, NMDA, glutamate의 독성으로 인하여 세포 사멸 유도 시 발현되는지를 관찰했으며, 이러한 독성 물질들을 처리했을 때 cyr61 발현에 관여하는 하위 신호전달 경로를 알아보았다. 먼저 위의 여러 독성 물질들을 처리하였을 때 흰쥐 해마세포에서 유래된 신경선조 세포주 (H19-7)에서 cyr61이 발현됨을 확인했다. 이를 더 자세히 분석하기 위해 etoposide를 H19-7 세포주에 처리하여 세포 사멸을 일으켰고, 이 때 cyr61의 mRNA 수준, promoter의 CAT 활성도, Cyr61 단백 발현 정도가 모두 증가함을 관찰 하였다. 이러한 cyr61의 발현 경로는 p38 kinase나 ERK가 아닌 JNK 활성을 통해 이루어짐을 RT-PCR과 Northern blot으로 관찰하였다. 4가지의 cyr61 deletion promoter construct (p1763cyr61/CAT, pDBglⅡcyr61/CAT, p529cyr61/CAT, p529CArGcyr61/CAT)의 CAT 활성도 측정을 통해서 etoposide에 의한 세포 사멸시 cyr61의 발현이 SRE에 의해서 매개된다는 것을 알았다. 또한 SRE에 결합하는 것으로 알려진 SRF는 etoposide를 처리 했을 때 활성화되는 JNK에 의해 직접적으로 인산화 됨을 in vitro kinase assay를 통해서 확인할 수 있었다. 이상의 결과에서 immediate early gene cyr61이 세포 사멸과정에서 JNK 경로를 통하여 발현이 되며, cyr61 promoter 부위에 위치한 SRE가 발현에 중요한 역할을 할 뿐만이 아니라, 합성된 Cyr61 단백이 세포 밖으로 분비됨을 확인하였다.

[영문]

Immediate early gene (IEG) cyr61, a cysteine-rich and heparin-binding protein, belongs to the CCN family [cysteine-rich 61 connective tissue growth factor (CTGF) nephroblastoma overexpressed]. This emerging new family of proteins is characterized by a high degree of amino acid sequence homology and includes Cyr61, CTGF, Nov, elm-1, cop-1, and wisp-3. These proteins are organized into conserved modular domains that share similarities with insulin-like growth factor binding proteins, von Willebrand factor type C repeat, thrombospondin type Ⅰrepeat, and growth factor cysteine knots. In addition, each of these proteins possesses an amino-terminal signal peptide, indicating that they are secreted proteins. cyr61 is transcriptionally activated within minutes by serum, bFGF, or PDGF. The encoded Cyr61 protein is secreted into extracellular matrix, and promotes cell adhesion and migration. The cyr61 promoter has been shown to respond to induction by serum via a

serum response element (SRE). The SRE is occupied by a dimer of serum response factor (SRF) and ternary complex factor (TCF). In the present study, we examined whether cyr61 is expressed during neuronal cell death induced by various toxic-stimuli. Northern blot and RT-PCR analysis showed that cyr61 is expressed during neuronal cell death induced by many toxic agents, including etoposide in CNS hippocampal cells (H19-7). To clarify the downstream signaling cascades for the induction of cyr61, the blocking effect of JNK or p38 kinase signaling pathway on the induction of cyr61 was tested in response to etoposide. Transfection of kinase-deficient mutant MEKK into H19-7 cells significantly decreased cyr61 expression induced by etoposide, whereas the levels of cyr61 induction did not change by pretreatment with p38 kinase inhibitor, SB203580, compared to the control cells. We also investigated the induction of the cyr61 promoter and deletion analysis of the cyr61 promoter indicated that cyr61 activation occurs primarily within the region containing a CArG box. Our results also indicate that SRF, which

binds to the CArG site, was phosphorylated by the JNK. Using metabolic labeling that the secretion of Cyr61 into the extracellular space occurs in response to etoposide also identified. Taken together, we conclude that 1) cyr61 is expressed during neuronal cell deth, 2) JNK activation mediated the expression of cyr61 and JNK phosphorylated to SRF which binds SRE motif in cyr61 promoter, 3) Cyr61 protein is secreted into the extracellular space during apoptosis.