초기 류마티스 관절염 환자에서 B 림프구의 클론성 팽창

Abstract

[한글]

류마티스 관절염은 자가면역 반응에 의한 대표적인 만성 관절염이다 류마티스 관절염의 병리기전에서 T 림프구는 초기의 면역 및 염증반응에 중추적 역할을 하며 B 림프구와 활막세포는 관절의 이차적인 파괴 및 손상에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 초기 류마티스 관절염은 증상 발현 1년 미만의 류마티스 관절염으로 그 기전에 있어 B 림프구의 관련성과 역할이 명확히 알려져 있지 않다. 면역글로불린의 제3상보성 결정부위(complementa.its determining region3; CDR3)는 3개의 CDR 중 변화가 파장 많은 부위로 항원과 직접 결합을 하는 부위이다. CDR3는 V(D)J 유전자 된절의 재배열에 의해 생성되며 다양성을 보여 B 림프구의 clonal marker로 사용되고 있다.

연구자는 초기 류마티스 관절염의 벙태 생리 기전에 B 림프구의 관련성을 화인하기 위하여 초기 류마티스 관절염 환자의 활막 조직에서 CDR3 다양성에 대한 연구를 통하여 B 림프구의 클론성 팽창을 확인하고 클론성 팽창된 면역글로불린 유전자를 클로닝하고자 하였다.

관절염의 증상 발생 후 5개월 되고 류마티스인자가 양성인 초기 류마티스 관절염 환자의 활막 조직 림프구와 말초혈액 림프구 그리고 정상인의 말초혈액 림프구에 대하여 CDR3 fingerprinting analysis를 시행하였으며 폴리아크릴아마이드겔에서 dominant band를 클로닝하여 CDR3 염기서열을 확인하였다. 확인된 염기서열을 이용하여 CDR3 probe를 합성하고 colony hybridization을 시행하여 클론성 팽창을 보인 B림프구리 면역글로불린 가변부위의 염기서열을 확인하였다.

정상인과 초기 류마티스 관절염 환자의 말초혈액에서 면역글로불린 μ 중쇄의 CDR3는 유사한 분포를 널였으며 초기 류마티스 관절염 환자의 활막에서 면역글로불린 중쇄의 CDR3는 다양하고 뚜렷한 clonality를 보였다. 면역글로불린 μ중쇄의 V_(H)I과 V_(H)4 family에서 CDR3 fingerprinting analysis상 보이는 dominant band를 클로닝하여 동일한 CDR3 염기서열을 보임을 확인하였다

Colony hybridization후 V_(H)가변부위 전체를 클로닝하였다. 면역글로불린 μ중쇄 V_(H)1 family에서는 5.1%의 클론성 팽창을 보였으며, 이 클론들은 V1-4.1B, D1-26, J_(H)3B1 유전자 분절의 재배열에 의해 만들어졌고 CDR에서 치환돌연변이와 비치환 돌연변이의 비(replacement mutation/silent mutation ratio;R/S 비)가 1/0으로 치환 돌연변이만 관찰되었다. 면역글로불린 중쇄 V_(H)4 family에서는 5.9%의 클론성 팽창을 보였으며 V4.39, D5-12, J_(H)2 유전자 분절의 재배열에 의해 만들어졌고 CDR에서 R/S비가 10/2(5.0)으로 나타나 항원에 의해 클론성 팽창이 나타났음을 추정할 수 있었다.

초기 류마티스 관절염 환자의 활막에서 면역글로불린 γ 중쇄의 CDR3는 fingerprinting analysis상 dominant band를 보이지 않아 클론성 팽창의 소견이 없음을 알 수 있었다.

결론적으로 초기 류마티스 관절염 환자의 활막 조직에서 B 림프구의 클론성 팽창이 있음을 확인하였고, 이는 항원에 의해서 유도되었을 것으로 생각되어 초기 류마티스 관절염의 병인에 B 림프구가 관여하고 있음을 확인하였다. 향후 클론성 팽창을 보인 클론을 이용하여 재조합 항체를 합성한다면 초기 류마티스 관절염의 원인항원을 찾고 병태생리를 밝히는 데 많은 도움을 줄 것으로 생각된다.

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핵심되는말 : 초기 류마티스 관절염, 활막 조직, B림프구, 클론성 팽창, CDR3

[영문]

Several studies have tried to find evidence for B cell oligoclonal expansion in longstanding rheumatoid arthritis(RA) synovium. The optimal time to investigate antigen-driven B cell response in the synovium is during the early phase of RA. The objective of this study is to find evidence of a clonally-expanded immunoglobulin heavy chain in the synovium of an early RA patient.

Peripheral blood lymphocyte (PBL) and synovial tissue were obtained from an early RA patient of 5 months duration, and PBL from an age- and sex-matched healthy adult as control. Complementarily determining region 3 (CDR3) fingerprinting analysis was performed. Briefly, RNA was isolated and CDNA was synthesized with M-MLV reverse transcriptase. Two-stage PCR was performed to amplify the CDR3 region using family-specific primers for heavy chain variable region. CDR3 regions were separated according to their lengths by running polyacrylamide gel electrophoresis.

Restricted bands were cut and cloning and sequencing were performed. With a synthetic oligonucleotide probe from the CDR3 region, cfllony hybridization was done for first PCR product. Immunoglobulin variable region sequence containing an identical CDR3 region with the probe was searched.

In control PBL and early RA PBL, similar pattern of CDR3 lengths was observed in V_(H)I-6 families of γ heavy chain but multiple restricted bands in V_(H)I-6 families of μ heavy chain. In early RA synovium, however, multiple restricted CDR3 bands were seen in V_(H)I, 3, 4, 5 families of μ heavy chain, but no restricted

CDR3 band was shown in γ heavy chain families. The clonally expanded μ heavy chain sequences containing V_(H)I (5.1%) alld V_(H)4 family (5.9%) were found. The variable region sequence of V_(H)1 clone(RAm1-1) was produced from germline Vl-4.1B, D1-26, and J_(H)3B1, and the variable region sequence of V_(H)4

clone(RAm4-1) from V4.39, D5-12, and J_(H)2 gene segment.

Clonal expansion was observed only in μ heavy chain but not γ heavy chain.

These data show that there are oligoclonal B cell expansion in early RA synovium and that dntigen-driven B cell immune responses might be involved in early RA synovium.