근육모세포의 분리 배양과 성장인자가 세포증식에 미치는 영향

Abstract

최근 뒤시엔느 (Duchenne)형 근디스트로피를 포함한 염색체 이상으로 인한 근육질환의 치료방법으로 정상 근육모세포를 환자의 근육에 주입하여 디스트로핀을 생성하도록 유도하는 근육모세포 (myoblast) 이식의 임상실험이 시도되고 있다. 그러나 근육모세포의 배양과정 중 비근육생성 세포 (non-myogenic cell), 특히 섬유모세포 (fibroblast)의 과도한 성장이 순수배양에 큰 장애로 나타나 이를 제거하고 근육모세포만을 배양하는 것이 중요한 관건이다. 또한 분리 배양된 근육모세포는 근관세포 (myotube)로 분화하지 않고 satellite cell 상태로 증식되어야 세포이식에 이용할 수 있는데 이를 위한 방법 중 하나가 성장인자 (growth factor)를 첨가하여 세포의 분화와 성장을 조절하는 것이다.

본 연구에서는 성인의 근육조직을 채취하여 단일 세포 상태로 분리한 후 일차 배양된 혼합 세포군을 자장을 이용한 세포 분리 (magnetic-activated cell sorting, MACS), 보체 (complement) 반응, 부착률 차이를 이용한 세포 분리 (preplating) 등의 방법으로 근육모세포를 섬유모세포가 대부분을 차지하는 비근육생성 세포들에서 분리하여 배양하였다. 또한 성장인자가 배양과정 중 근육모세포와 섬유모세포 증식에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 interleukin-1 (IL-1), leukemia inhibitory factor (LIF), basic fibroblast growth factor (bFGF)를 첨가하여 배양하였다. 그리고 이러한 일련의 분리와 증식을 위한 처리가 근육모세포의 분화 기능에 변화를 일으키는지 관찰하였으며 다음과 같은 연구 결과를 얻었다.

1) 근육세포 분리에서 MACS를 이용한 결과 평균 11.7%의 근육모세포의 비율 증가가 관찰되었다. 그러나 보체매개 세포독성 (complement mediated cytotoxicity)을 이용한 경우에는 실험 전 34.0%에서 실험 후 37.4%로 분리의 효과가 없었으며 (p>0.05), 섬유모세포뿐만이 아니라 근육모세포의 파괴도 같이 일어나는 것이 관찰되었다. Preplating은 배양단계가 진행될수록 근육모세포의 비율이 높아졌고 제 5단계에서는 83.1%까지 근육모세포의 비율을 높일 수 있었다. Preplating 후 다시 MACS로 분리하여 배양한 결과 근육모세포의 비율은 92.8%까지 높아졌다.

2) 성장인자를 투여한 대부분의 군에서 대조군과 비교하여 근육모세포 수가 증가되었다 (p<0.05). 각 성장인자의 농도에 따른 변화는 IL-1은 0.01 ng/㎖, LIF는 0.03ng/㎖, FGF는 1.5 ng/㎖에서 증가율이 가장 높았고 이 중 bFGF 1.5 ng/㎖의 경우가 대조군에 비해

근육모세포가 3.42배로 가장 많이 증가되었다. 그러나 섬유모세포에 대한 성장인장의 증식 효과는 대조군과 비교하여 차이가 없었다 (p>0.05).

3) MACS로 분리된 근육모세포와 성장인자로 처리된 모든 실험군의 근육모세포는 배양액을 1% FBS-DMEM (fetal bovin serum-Dulbeco's modified Eagles medium)으로 교환한 다음 약 5-7일 후 근관세포로 분화되었다.

이러한 결과를 종합하여 볼 때, 근육모세포의 분리에 preplating과 MACS를 혼합한 방법을 사용하면 비교적 높은 비율의 근육모세포를 얻을 수 있고 배양과정 중 적절한 성장인자를 선택하여 첨가한다면 섬유모세포의 증식을 자극하지 않고 근육모세포만 선택적으로 대량 배양할 수 있을 것으로 판단된다.

[영문]

Recently, cultured myoblast transplantation has been extensively studied as a gene complementation approach in such genetic diseases as Duchenne muscular dystrophy (DMD). This approach has been recognized as being capable of delivering dystrophin,

the product missing in DMD muscle, as well as leading to strength enhancement in the dystrophic muscle. Nonetheless, numerous limitations including immunological problems, a rate of low spread, poor survival of the injected myoblasts, and an insufficient number of myoblasts have hindered this approach. Furthermore, two major limitations in developing enough myoblasts for engrafting purposes are the isolation and purification of myoblasts and the maintenance of satellite cell state without differentiation into myotube before transplantation.

In the present work we attempted to purify myoblasts from the primary culture using a magnetic-activated cell sorting (MACS), complement mediated cytotoxicity, and preplating technique. In addition, we investigated the stimulating effects of the growth factors, interleukin-1 (IL-1), leukemia inhibitory factor (LIF), and basic fibroblast growth factor (bFGF) had on growth rate and differentiation of myoblast. As a result, a positive selection of myoblasts using MACS increased the number of myoblasts from 30.0% in mixed culture to 41.7%. However there were no significant increments of myoblast in complement mediated cytotoxicity (p>0.05). Moreover, there were lysis of myoblasts as well as fibroblast after complement reaction. Enrichment of myoblasts using the preplating technique was found to increase to 83.1%. In addition, higher purification (92.8%) could be achieved using

MACS after preplating technique. IL-1, LIF, and bFGF were found to stimulate myoblast proliferation without disturbance of differentiation into myotube, yet there were no statistically significant differences among different growth factors (p>0.05). The most significant growth stimulation of myoblasts in culture was achieved by adding 1.5 ng/㎖ of bFGF, producing a stimulation effect up to 3.42-fold. All myoblasts treated with MACS, preplating and growth factors differentiated into myotube.

In conclusion, we could get relatively enriched myoblasts using preplating technique and MACS. Also, our findings indicate that growth factors (IL-1, LIF, bFGF) stimulate the proliferation of myoblast, which may result in an effective way in producing large numbers of myoblasts for clinical myoblast transplantation in

DMD patients.