비스테로이드성 소염제(NSAIDs)에 의한 세포사멸과정에서 Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) 활성화의 역할

Abstract

[한글]

비스테로이드성 소염제에 의한 항암효과의 기전은 아직 알려지지 않은 부분이 많으며, 이러한 기전 중의 하나로 세포사멸 유발이 보고되어왔다. 본 연구는 세포 증식과 사멸과정의 중요한 매개체 중의 하나로 알려져 있는 mitogen-activated protein kinase (MAPK)가 비스테로이드성 소염제에 의한 대장암 세포의 사멸과정에서 어떠한 역할을 하는지 규명하고, 세포사멸에 의미있는 MAPK 활성화와 가능성 있는 관련 신호전달 경로로서 nuclear factor kappa B (NFκB) 및 peroxisome proliferator-activated receptorγ (PPARγ)의 연관성을 알아보고자 하였다. 대장암 세포주인 HT-29에 indomethacin을 농도 및 시간별로 처리한 후 trypan blue dye exclusion 방법으로 세포사를 측정하였고, 세포사멸은 agarose gel 전기영동상의 DNA 분절로 확인하였다. MAPK 활성화는 MAPK에 대한 인산화 특이항체를 이용한 Western blot으로 측정하였고, extracellular signal-regulated kinase (ERK)와 p38 MAPK의 억제를 위하여 각각 PD098059와 SB203580을 사용하여 이에 의한 세포사멸의 변화를 관찰하였으며, 이 과정에서 caspase-3 활성의 변화도 측정하였다. Hemagglutitin (HA)이 표식된 c-Jun N-termina l kinase (JNK) 발현 plasmid와 JNK dominant negative plasmid를 transfection시킨 후 fluorescein isothiocyanate (FITC)가 표식된 HA에 대한 항체와 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)를 이용한 면역형광염색법으로 JNK가 과발현 또는 억제된 세포에서의 핵모양을 관찰하여 세포사멸에 대한 JNK의 역할을 알아보았다. 그리고 NFκB 결합 부위를 가진 luciferase reporter 또는 PPRE3-tk-luciferase reporter plasmid를 transfection시킨 후 indomethacin, SB203580 그리고 PPARγ길항제(BADGE)에 의한 전사 활성화의 변화를 luciferase assay로 분석하였다. 이상의 방법으로 다음의 결과를 얻었다.

1. HT-29 세포주에 indomethacin (0.1∼1 mM)을 처리하였을 때 세포사멸 소견과 함께 시간별, 농도별로 ERK, JNK/SAPK, 그리고 p38 MAPK의 지속적인 활성화 소견이 관찰되었다.

2. p38 MAPK 억제제(SB203580)를 전처치 한 경우 indomethacin에 의한 세포사가 43% 감소하였으며, agarose gel 전기영동상의 DNA 분절소견도 유사한 정도로 감소하였다. 그러나 MAPK/ERK kinase 1 (MEK1) 억제제(PD098059)의 전처치는 indomethacin에 의한 세포사

에 영향을 주지 못 하였고, JNK 발현 plasmid와 JNK dominant negative plasmid의 transfeciton에 의한 JNK 과발현과 억제도 세포사멸과정에 영향을 주지 못하였다.

3. Indomethacin을 처리한 HT-29 세포에서 p38 MAPK 억제제(SB203580)의 전처치는 caspase-3 활성화를 억제하지 못하였으며, 반대로 caspase 억제제(Ac-DEVD-CHO, Ac-YVAD-CHO, Z-VAD-FMK)의 전처치도 p38 MAPK 활성화에 영향을 주지 못하였다. 이로서 p38 MAPK 활성화와 caspase-3 활성화는 상호 유의한 연관관계가 없음을 확인하였다.

4. Tumor necrosis factorα (TNFα)에 의해 활성화된 NFκB 매개 유전자 발현이 indomethacin에 의해 억제되었으나 p38 MAPK 억제제(SB203580) 또는 PPARγ길항제(BADGE)는 indomethacin의 NFκB 억제작용에 영향을 주지 못하였다.

5. Indomethacin은 PPARγ매개 유전자 발현을 증가시켰으나 p38 MAPK 억제제(SB203580) 전처치의 의미있는 영향이 없었으며, indomethacin에 의한 세포사멸에서도 PPARγ길항제(BADGE)의 세포사멸 억제효과는 없었다.

이상의 결과를 요약하면, indomethacin은 대장암세포주 HT-29에서 3가지 MAPK (ERK, JNK/SAPK, p38 MAPK)를 모두 활성화시켰다. 이중에서 p38 MAPK 활성화는 indomethacin에 의한 세포사멸과정에서 부분적이지만 중요한 역할을 하며, caspase 활성화 경로와는 독립적

으로 작용할 것으로 생각된다. 이러한 p38 MAPK의 활성화는 indomethacin에 의한 NFκB 억제작용이나 PPARγ활성화 작용과 의미있는 연관관계는 없었다.

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핵심되는 말: 비스테로이드성 소염제, mitogen-activated protein kinase (MAPK), 세포사멸

[영문]

The mechanisms of the anti-neoplastic effect of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) still remain unknown, but the induction of apoptosis is one of the possible mechanisms. We have attempted to demonstrate the role of mitogen-activated protein (MAP) kinases, which are generally considered to be important mediators of proliferative and apoptotic signals, in NSAIDs-induced colon cancer cell apoptosis. Furthermore we have evaluated the relation of other possible mediators such as NFκB and PPARγ, which were known to be associated with NSAIDs-induced cellular response. Apoptosis was detected by demonstration of DNA fragmentation in agarose gel electrophoresis. Cell death was assessed by trypan blue dye exclusion method. MAP kinase activation was assessed by Western blot using phospho-specific

antibodies to MAP kinases. Kinase assay using activating transcription factor-2 (ATF-2) fusion protein as a substrate was also performed for the measurement of p38 MAP kinase activity. For the inhibition of ERK and p38 MAP kinase, PD098059 and SB203580 were utilized respectively. To demonstrate the role of JNK, HA epitope-tagged JNK or dominant negative JNK plasmid were transiently transfected, and the change of nuclear shape due to overexpressed or suppressed JNK activity was estimated by immunofluorescence study using the FITC-conjugated anti-HA monoclonal antiby and DAPI. Caspase-3 activity was measured using tetrapeptide fluorogenic substrate, Ac-DEVD-AMC. To evaluate the activities of NFκB and PPARγ and their association with MAPK activation, luciferase construct containing NFκB binding sites or PPRE3-tk-luciferase construct were transfected and transcriptional activities were measured by luciferase activity. Treatment of HT-29 cells with NSAIDs results in a time- and dose-dependent induction of apoptosis, accompanied by a sustained activation of all three MAP kinase subfamilies. SB203580, a p38 MAP kinase inhibitor, reduced indomethacin-induced apoptosis by 43 %, while PD098059, MEK1 inhibitor, did not affect cell death. Overexpressed or suppressed JNK activity also did not affect indomethacin-induced apoptosis. p38 MAP kinase and caspase-3

activation were not significantly inter-linked in indomethacin-induced apoptosis.

Indomethacin suppressed the transcriptional activation of NFκB and induced the transcriptional activation of PPARγ. However, the activity of NFκB and PPARγ were not affected by p38 MAPK inhibitor. From these results, we conclude that NSAIDs can induce the prolonged activation of MAP kinases in colon cancer cells and

that of these, p38 MAP kinase may play a partial but significant role in indomethacin-induced apoptosis. Furthermore, indomethacin-induced and p38 MAPK-mediated apoptosis of colon cancer cells is independent of caspase activation and not associated with indomethacin-induced suppression of NFκB and activation of PPARγ.