자궁평활근 수축에 rho A/ROK에 의한 Ca2+ sensitization의 역할

Abstract

[한글]

임신 쥐의 자궁평활근에서 여러 가지 수축제에 의해 증가된 수축력은 분만에 매우 중요한 역할을 한다. 이러한 수축제는 G-단백질에 의해 조절되는 기전을 통해 자궁평활근 수축요소의 Ca^2+ 에 대한 감수성 (Ca^2+ sensitivity)을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한 쥐와 사람의 자궁평활근에서 rho A 및 rho-associated kinase (ROK)의 mRNA의 양이 비 임신 쥐 보다 증가됨이 보고되었으며, rho A와 ROK이 carbachol 자극에 의해 세포질에서 세포막으로 전위(translocation)되는 것이 보고되었다. 비록 이러한 보고들이 임신 쥐의 자궁평활근에서 rho A 및 ROK이 Ca^2+ sensitization에 관여한다고 제안을 하지만 아직까지 임신 쥐 자궁평활근의 Ca^2+ sensitization에 rho A 및 ROK의 역할을 직접적으로 규명한 연구는 없었다. 이에 본 연구에서는 임신 쥐 자궁평활근에서 수축력과 세포내 Ca^2+ 농도, 투과성이 증가된 단일세포에서 수축력, western blot 및 20 kDa myosin light chain (MLC20) 인산화를 측정함으로서 protein kinase C (PKC)와 rho A 단백질에 의한 Ca^2+ sensitization이 임신기간동안 자궁평활근의 수축력 증가에 관여하는지를 규명하고자

실험하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

임신 쥐의 자궁평활근에서 carbachol은 세포내 Ca^2+ 농도와 장력을 동시에 증가시켰으며, 주어진 Ca^2+ 농도에서 고농도 K^+ 용액보다 큰 수축력을 보였다. ROK 억제제인 Y-27632는 carbachol에 의한 세포내 Ca^2+ 농도의 증가에는 거의 영향이 없었으나 수축은 통계적으로 의의있게 감소시켰다. PKC 억제제인 staurosporine 역시 carbachol에 의한 세포내 Ca^2+ 농도의 증가에는 거의 영향이 없었으나 수축은 다소 감소 시켰다. 그러나 그 감소정도는 통계적으로 유의하지 않았다. 투과성이 증가된 단일세포에서 carbachol은 pCa 6.7에서 점진적이나 지속적으로 유지되는 수축을 유발하였다. 이러한 carbachol에 의한 수축은 Y-27632와 staurosporine에 의해 억제되었으나 Y-27632의 경우에만 통계적으로 유의하였다. 자궁평활근에서 immunoblotting 결과 PKCα, PKCβ, PKCζ 및 PKCε이 존재하였고 rho A 역시 존재하였다. Carbachol이 rho A의 활성화에 미치는 영향을 규명하기 위해 이의 전위정도를 관찰해 본 결과 rho A 단백질이 carbachol에 의해 세포질에서 세포막으로 전위되었다. Carbachol은 MLC20 인산화를 증가시켰으나 이러한 증가는 Y-27632에 의해 억제되었다.

이상의 실험결과를 종합하여 볼 때 임신 쥐의 자궁평활근에서 carbachol에 의한 수축은 세포내 Ca^2+ 농도의 증가와 Ca^2+ sensitization 기전에 의해 일어남을 알 수 있었다. 또한 Ca^2+ sensitization에는 rho A/ROK을 통한 MLC20 인산화의 증가가 중요한 역할을 하며 PKC도 어느 정도 관여할 것으로 생각된다.

[영문]

The contractions of the myometrium augmented by a variety of uterotonic agents play an important role at parturition. These agonists have been reported to augment the Ca^2+ sensitivity of the myometrium through a receptor-coupled, G-protein-mediated mechanism that has been suggested, in part at least, to be

mediated via activation of rho-associated kinase (ROK). Interestingly, in myometria from both rat and humans the mRNA expression of rhoA and ROK in the pregnant myometrium was increased in comparison to those in the non-pregnant myometrium. We have also previously demonstrated in single isolated myometrial cells that rhoA and ROK translocate from the cytosol to the membrane after carbachol stimulation supportive of the notion that membranous relocalization of rhoA/ROK are necessary

for agonist-induced Ca^2+ sensitization. Although the above reports are suggestive of an involvement of rhoA and/or ROK in the Ca^2+ sensitization phenomenon, the extent of the putative role of rhoA and ROK in the contractile regulation of pregnant rat myometrium has not been fully elucidated. Therefore, in the present study we examined the role of rhoA/ROK and protein kinase C (PKC), one of candidate for Ca^2+ sensitization, on the Ca^2+ sensitization of carbachol-induced contraction of the myometrium by measuring force production in single permeabilized cells, fura-2 Ca^2+ signals and tension in intact tissues and the translocation of the rhoA and phosphorylation of MLC20 following agonist stimulation.

In measurements of the relationship between intracellular Ca^2+ concentration ([Ca2 ]i) and tension, carbachol evoked greater contraction than high K+ at a given [Ca2 ]i. Y-27632, a ROK inhibitor, significantly decreased the carbachol-induced contraction without changing [Ca2 ]i but staurosporine, a PKC inhibitor, slightly decreased carbachol-induced contraction. In tension measurements of single hyperpermeable cells, carbachol evoked sustained contraction at pCa 6.7 and the carbachol-induced contractions were decreased by treatment with Y-27632 but not

staurosporine. Immunoblotting using isoform-specific antibodies showed the presence of PKCα, PKCβ, PKCζ, PKCε and rho A in the pregnant rat myometrium. Rho A was translocated from the cytosol to the cell membrane by carbachol. Phosphorylation of

MLC20 was increased by carbachol and the increased phosphorylation was blocked by treatment of tissue with Y-27632.

These results suggest that activation of rho A/ROK pathways does play important role in carbachol-induced Ca^2+ sensitization in pregnant rat myometrium.