Protein tyrosine phosphatases에 효과적인 저해제 탐색

Abstract

[한글]

Protein tyrosine kinases (PTK)와 protein tyrosine phosphatases (PTP)에 의한 가역적인산화 반응의 조절은 인슐린 신호전달을 비롯한 다양한 세포 내 신호전달과정에서 중요한 역할을 한다. PTP는 세포 내 다양한 기질들을 탈인산화시킬 수 있는 기질 특이성이 낮은 효소로 알려져 왔으나, 최근 knockout생쥐 실험등으로 다양한 PTP는 생체 내에서 각기독특한 기능을 하고 있는 것으로 밝혀지고 있다. 따라서 다양한 PTP에 대한 매우 선택적이고 강력한 저해제의 개발은 당뇨병을 비롯한 여러 가지 다양한 질환의 치료적 약물로서의 사용뿐만 아니라 각 효소의 생물학적 기능의 연구에 있어서도 유용할 것으로 사료된다

본 연구에서는 이러한 연구적 배경을 바탕으로 선택적인 PTP 저해제 개발의 선도물질(lead compound)로 사용될 수 있는 강력하고 가역적인 저해제를 찾고자 하였다. 특히, PTP 효소반응 결과물의 저해작용(end-product inhibition)에 초점을 맞추어 저해물질을 스크리닝하고자 하였다. PTP 효소반응 결과물인 phosphate와 그 유도체의 저해작용을 확인한 결과 vanadate, molybdate 그리고 tungstate가 PTP-1B (protein tyrosine phosphatase-1B)와 SHP-1 (protein tyrosine phosphatase containing two SH2 domains)에 대해 1.3-18 μM 범위의 저해상수를 가짐으로써 비교적 효과적인 저해효과를 보였다. 반면 phosphate 자체는 수백 μM범위에서도 저해효과를 나타내지 않았으며, 특징적인 것은 thiophosphate가 SHP-1에 대해 선택적인 저해양상을 보였다는 점이다. 다음으로 비교적 효과적 저해양상을 나타낸 물질들을 중심으로 이들의 유도체들을 스크리닝한 결과, phosphomolybdate (PM)와 phosphotungstate (PT)가 저해상수 0.06-1.2 μM의 범위로 PTP에 대해 아주 강력한저해효과를 나타내었다. 흥미롭게도 PM과 PT는 Ser/Thr phosphatase에 대해서는 비교적

약한 저해양상을 보였으며, alkaline phosphatase에 대해서는 저해양상을 전혀 나타내지 않았다. 따라서 PM과 PT는 PTP에 대한 강력하고 선택적인 저해제임을 알 수 있었다. 이러한 in vitro 실험 결과를 세포주 단계에서 처리해 봄으로써 치료적 약물로서의 효용성을

확인해 보고자 하였다. HepG2 세포주에 PM과 PT를 처리해 본 결과, 세포 내 인산화 단백질의 변화는 in vitro의 실험결과와 비교해 볼 때 효과가 미미하였는데, 이는 PM과 PT가 HepG2 세포막을 효과적으로 투과하지 못하는데 기인한 것으로 여겨진다. 결론적으로 PM과PT는 PTP에 대한 강력하고 선택적인 저해제이며 세포 내 전달이 가능하다면 당뇨병 치료제에 대한 선도물질로서의 가능성이 충분히 있다고 사료된다.

[영문]

Protein tyrosine phosphatases (PTPs) constitute a family of receptor-like and cytoplasmic enzymes that catalyze the dephosphorylation of phosphotyrosine residues in a variety of receptors and signaling molecules. Together with protein tyrosine

kinases (PTKs), PTPs are critically involved in regulating many cellular signaling processes. PTPs have been considered to have multiple unrelated cellular substrates, however, recently reported knockout mice deficient of particular PTPs all appear to exhibit unique phenotypes, suggesting that most PTPs would serve

unique, non-redundant functions. A role for PTPs in the negative regulation of insulin signaling and a putative involvement in the insulin resistance associated with typre 2 diabetes have been postulated. The recent demonstration that mice lacking the protein tyrosine phosphates-1B (PTP-1B) have enhanced insulin sensitivity validates this. Therefore, highly selective PTP inhibitors including PTP-1B could be used as therapeutic agents for diseases and significant progress in developing such agents is being made, though most inhibitors developed so far are potent but less selective.

In this study, we initiated screening of diverse compounds for PTP inhibition, focusing on the end product inhibition property of PTPs. By a systematic screening of phosphate analogues and their derivatives for PTP inhibition, we found that vanadate, molybdate, and tungstate effectively inhibited the catalytic activity of both PTP-1B and SHP-1 with Ki values between 1.3-18 μM, while thiophosphate selectively inhibited SHP-1 only. Remarkably, we found that phosphomolybdate (PM) and phosphotungstate (PT) inhibited the PTPs much more strongly than vanadate, a well-known and generally used PTP inhibitor, with Ki values of 0.06-1.2 μM. PM and PT turned out to be potent, competitive inhibitors for PTPs, but they appeared to be relatively poor inhibitors of Ser/Thr phosphatase. Interestingly, PM and PT did not inhibit alkaline phosphatase at all. Therefore, we found that PM and PT are excellent reversible inhibitors of PTP in vitro. In the further study, the efficacy of PM and PT as PTP inhibitors in intact cell was compared with that of vanadate

and pervanadate by measuring phosphotyrosine levels in HepG2 cell line treated with these compounds. In contrast to the result of inhibition in vitro, PM and PT were much more ineffective as PTP inhibitors in HepG2 cell line.

Therefore, we can suggest that by enhancing the ability of PM and PT to cross the cell membrane, it would be possible to be lead compounds for modulating the function of known therapeutic targets as well as type 2 diabetes.