사람 신세포암세포주의 bone morphogenetic proteins에 대한 반응과 그 수용체들의 발현

Abstract

[한글]

Bone morphogenetic proteins (BMPs)는 transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily로 골형성을 유도하는 물질로 처음 발견되었으나, 여러 연구들에 의하여 척추동물의 기관발생, 신경세포들의 분화, 상피세포를 포함한 여러 세포들의 성장 및 분화에 관련된 인자임이 밝혀졌다. BMPs는 전립선암을 비롯한 여러 종양의 형성에도 관여하는 것으로 보고되고 있으며, 특히 BMP-4와 -7은 신장의 발생에 중요한 분화인자로 밝혀져 신장암의 형성에도 관여할 것으로 생각되나 아직 보고된 바 없다.

BMPs의 세포내 신호전달은 세포막에 위치하는 I형 및 II형 BMP 수용체들의 상호 작용으로 시작된다. BMP ligand가 수용체에 결합되면 II형 수용체로부터 I형 수용체로 인산기의전달이 이루어지고, 연쇄적으로 Smad cascade가 활성화되면서 표적유전자의 발현이 일어

난다. BMP 수용체(BMPRs)는 지금까지 세 종류의 I형 수용체(ActR-I, BMPR-IA 및 BMPR-IB)와 세 종류의 II형 수용체(ActR-II, ActR-IIB 및 BMPR-II)가 발견되었으며, BMPR-IA, BMPR-IB와 BMPR-II가 BMP-specific receptors로 생각되고 있다.

본 연구에서는 BMPs와 신장암의 발생과의 관계를 알아보기 위해 BMP-4, -6 및 -7을 사용하여 일련의 사람 신세포암세포를 대상으로 BMPs의 농도에 따른 암세포들의 세포생존율을조사하였으며, 암세포들의 BMP 수용체 발현정도와 세포생존율의 관계를 알아보았다.

사람 신세포암세포주로는 112, 117 및 181을 사용하였으며, 연구결과 BMP-6는 농도에 의존적으로 신세포암세포주 112의 세포성장을 억제시켰으나, 신세포암세포주 117과 181의 세포성장에는 영향을 주지 못하였다.

사람 신세포암세포주 112에 pSBE4 (plasmid containing luciferase reporter gene underthe control of 4 tandem repeats of Smad binding element)를 transient transfection시킨 후, BMP-6 처리 전(0 ng/ml)과 후(100 ng/ml, 16시간) luciferase activity를 측정

한 결과, BMP-6 처리 후 의의있게 luciferase activity가 증가하여 BMP-6에 의한 세포내신호전달이 Smad cascade를 통해 일어남을 알 수 있었다. 반면에 사람 신세포암세포주 117 및 181에서는 BMP-6 처리 전후에 luciferase activity의 변화가 없었으나, BMPR-II 플라즈미드와 pSBE4를 transient co-transfection하고 BMP-6 처리 전(0ng/ml)과 후(100ng/ml 16시간)에 luciferase activity를 측정한 결과, 두 세포주 모두에서 BMP-6 처리 후 의의있게 luciferase activity가 증가하였다. 또한 각 세포주들을 대상으로 시행한 Norther

n blot analysis와 Western blot analysis에서 BMPR-II mRNA 및 BMPR-II의 발현이 사람 신세포암세포주 112에서는 모두 관찰되었으나, 사람 신세포암세포주 117 및 181에서는 모두 관찰되지 않았다.

이러한 결과는 사람 신세포암세포주 112는 BMPRs가 전사 및 단백번역 단계에서 모두 발현되어 BMP-6-BMPR ligation에 의해 Smad cascade pathway가 활성화되어 신호가 핵내로 전달되며, 이로 인해 사람 신세포암세포주 112는 BMP-6에 성장이 억제되었다는 것을 의미

한다. 반면에 사람 신세포암세포주 117과 181에서는 BMPR-II의 발현이 결여되어 Smad cascade pathway를 통한 신호가 전달될 수 없다는 것을 추측할 수 있었다. 따라서 사람 신세포암세포주 117과 181의 BMP-6 저항성이 결국 BMPR-II의 발현정도의 차이에서 기인함을 알 수 있었다.

이는 사람 신세포암세포에서 BMPR-II 과발현 유도로 암세포의 성상을 변화시킬 수 있는 가능성을 보여주었으며, 앞으로 이 분야에 대한 연구가 신장암 치료에 있어 또 다른 치료법 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

[영문]

Bone morphogenetic protein is a pleiotropic growth factor that has been suggested to play critical role during the development and homeostasis of kidney. In the present study, we evaluated the response of bone morphogenetic protein-4, -6, and -7 (BMP-4, -6, and -7 ) to the human renal cell carcinoma cell lines, 112, 117, and 181. There were no growth inhibitory effect of BMP-4 and -7 on these three cell lines. However, the effect of BMP-6 was correlated with the expression of BMP receptors (BMPRs) in the human renal cell carcinoma cell lines, 112, 117, and 181.

Of these three cell lines, BMP-6 inhibited the proliferation of 112 cells but not 117 and 181 cells in a dose-dependent manner. By Northern blot and immunoblot analysis, it was demonstrated that 117 and 181 cells have undetectable levels of expression of BMP receptor type II (BMPR-II).

To demonstrate that the level of defect in BMP-6 signaling is at the receptor level, the two BMP-6 resistant cell lines were infected with adenovirus containing constitutively active form of BMP receptor types IA and IB (BMPR-IA-CA and IB-CA, respectively). After the infection, the cells were transfected with pSBE4, a BMP-6-responsive luciferase reporter construct. The results demonstrated that the level of luciferase activity following adenovirus infections was elevated in both 117 and 181 cells, suggesting that the down-stream signaling molecules of BMP-6 is intact in these cell lines. Finally to demonstrate that the insensitivity to BMP-6 is due to the decreased levels of expression of BMPR-II, these cells were transiently co-transfected with BMPR-II and pSBE4. The results demonstrated that

BMP-6 signaling was restored following transfection with BMPR-II. Taken together, these results demonstrate that the human RCC cell lines 117 and 181 are resistant to the growth inhibitory effect of BMP-6 because they have decreased levels of expression of BMPR-II.