임상적 protein S 결핍증에서 PROS1 유전자 변이 탐색

Abstract

[한글]

Protein S의 유전성 결핍증은 혈전증의 위험인자로서 알려져 있으며, 선진 외국의 경우 분자유전학적 연구가 활발하여 해당 유전자(PROS1) 내 약 130여종의 돌연변이(mutation)와 약 20종의 다형성(polymorphism) 양상이 알려져 있다. 그러나 국내에서는 protein S의 유전성 또는 후천성 결핍증에 대한 연구가 미미한 실정이고 임상적으로 혈전증 환자에서 원인적 검사로서 혈중 protein S를 측정하고 있으나 실제로 결핍증을 나타낸 환자에서 유전적 검색 자료는 아직 없다. 이에 임상적으로 protein S 결핍증으로 진단된 환자에서 유전적 결함의 빈도 추정과 함께 한국인에서 처음으로 PROS1 유전자 변이 양상을 관찰하여 이제까지 보고된 외국인의 변이 양상과 비교하고자 하였다.

이를 위해 최근 10년간 임상적으로 protein S 결핍증을 나타낸 60예의 환자에서 PROS1 유전자 내 15개 exon 및 exon/intron junction 부위를 SSCP 스크리닝과 DNA sequencing으로 조사하여 일본에서 보고된 protein S Tokushima를 포함한 유해 돌연변이(detrimental

mutation)의 빈도와 임상적 관심이 높은 protein S Heerlen, 외국에서 보고된 다빈도 다형성에 해당되는 intron K 부위의 T/C (PIPS1), exon 15 부위의 3' untranslated trailer의 exonic C/A (PEPS2)와 G/A (Pro626) 양상에 대하여 알아보았다. 또한 정상 대조군 50예를 대상으로 PIPS1, PEPS2, Pro626 (exon15) 유전자의 대립인자 비율을 산출하여 환자군과의 차이 유무를 관찰하였다.

임상적 protein S 결핍증 60예를 대상으로 모든 exon과 exon/intron junction 부위를 SSCP 스크리닝 후 염기서열 분석으로 확인한 결과 유해 돌연변이에 해당되는 예는 없었으며, 대신 3예에서 PROS1 유전자의 exon 14 근처 intron N 부위에서 T 및 G insertion이 관

찰되었다. 이는 아직 국제적으로 보고되지 않았으나 coding region이 아니고 정상인에서도 발견되었기 때문에 유전적 protein S 결핍증과는 연관성이 없는 다형성으로 생각되었다. 또한 protein S Tokushima 및 protein S Heerlen도 protein S 결핍증과 정상 대조군 모두에서 관찰되지 않았다. PIPS1의 T/C 대립인자 비율은 protein S 결핍증에서 0.813/0.187, 정상 대조군에서 0.569/0.431로서 두 군간에 통계적으로 유의한 차이를 보였다(P=0.002). PEPS2의 C/A 대립인자 비율은 protein S 결핍증에서 0.825/0.175, 정상 대조군에서 0.840/0.160으로서 두 군간에 통계적으로 유의한 차이는 없었다(P=0.993). Pro626 (exon15) 부위의 G/A 대립인자 비율은 protein S 결핍증에서 0.702/0.298, 정상 대조군에서 0.656/0.344로서 두 군간에 통계적으로 유의한 차이는 없었다(P=0.924).

결론적으로 SSCP검사의 예민도에 한계가 있겠으나 임상적으로 관찰되는 protein S 결핍증의 대부분이 유전적 결함보다는 후천적 요인에 의한 것으로 사료되었다. 이는 임상적으로 관찰되는 결핍증을 모두 유전적으로 간주할 수 있는 오류를 배제하는 데 도움이 되는 자료로서 향후 원인 규명에 있어서 고비용의 분자유전학적 유전자 검사보다는 후천적 요인에 대한 고려와 가족검사를 통한 진단적 접근이 바람직할 것으로 생각되었다. 또한 PROS1 유전자 변이 양상(polymorphism)이 외국인과는 차이가 있으며 특히 PIPS1 유전자 다형성에 대하여 보다 많은 한국인을 대상으로 연구가 필요하고 임상적 의의에 대한 연구도 필요하다고 생각한다.

[영문]

Protein S is a vitamin K dependent protein whose inherited deficiency is a well recognized risk factor for thrombosis. Elucidation of the gene defect responsible for protein S deficiency is proceeding rapidly and over 130 mutations in the

protein S gene (PROS1) as well as the three frequent polymorphisms and 18 different sequence variations have been identified to date. However, only a few cases with protein S deficiency, which were diagnosed on the basis of phenotypic measurements of plasma levels, have been reported without evidence of genetic mutation in Korea. Therefore, this study performed genetic analysis of PROS1 gene in clinical patients

with low plasma protein S level to detect detrimental mutations or sequence variations including the three frequent polymorphisms, thereby, in order to estimate the prevalence of hereditary defects and to establish allelic frequencies

in Koreans.

Genomic DNA amplifications from protein S deficient patients (n=60) for each of the 15 individual exons and exon/intron junction regions of the PROS1 gene were screened according to the protocol by Reitsma, et al. (1994) using single stranded conformation polymorphism (SSCP) method, and direct DNA sequencings were performed in the cases with mobility shift on SSCP screening. In addition, PCR-RFLP analysis for protein S Heerlen, which is not clear whether this mutation is a polymorphism or a detrimental mutation, as well as for three frequent polymorphisms including PIPS1 (intron K T/C), PEPS2 (3' UTR of exon 15 C/A) and Pro626 (exon 15), were also carried out in the protein S deficient patients and in normal controls (n=50).

Any detrimental mutation including Protein S Tokushima, which was identified in Japanese families, as well as protein S Heerlen, was not found in all patients with protein S deficiency. A novel polymorphism of T and G insertions in the intron N

near exon 14 was found in 3 patients, which also occurred in 1 normal control. The PIPS1 allelic frequencies of T/C were 0.813/0.187 in the patient group and 0.569/0.431 in normal control group, which were significantly different (P=0.002).

The allelic frequencies of C/A PEPS2 and G/A Pro626 were 0.825/0.175 and 0.702/0.298 respectively in the patient group, and 0.840/0.160 and 0.656/0.344 in normal control group, which were not statistically different.

In conclusion, the prevalence of hereditary protein S deficiency in Korean population seems to be very rare, suggesting that acquired protein S deficiency takes most part of protein S deficiency rather than hereditary defects in clinically diagnosed cases. The established allelic frequencies of three frequent

polymorphisms and a novel polymorphism detected in this Korean study suggest that there is some ethnic difference, compared with other populations including Caucasians.