3'-Methyl-4-dimethylaminoazobenzene으로 유도한 백서 간장암 세포막에서 포도당 운반체의 전위 조절 기전에 관한 연구

Abstract

[한글]

세포가 변형되는 과정에서 초기변화의 하나로 세포내로 포도당 이동이 증가된다는 사실이 Warburg (1956)에 의해 관찰된 이후 세포가 변형(transformation)되면 정상세포에 비해 포도당 흡수와 대사의 속도가 중가된다고 알려져 왔다. 이때 포도당 이동의 중가는 아마도 포도당 운반체의 활성과 관련이 있을 것으로 생각되나 변형된 세포에서 관찰되는 포도당 이동속도 중가현상에 대한 정확한 분자론적 기전은 아직 잘 모르고 있다.

따라서 본 연구는 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene(3'-Me DAB)으로 백서에 간장암을 유발시켰을 경우 원형질막내 포도당 운반체의 표현이 증가되는 원인이 세포내 소기관인 low density microsome으로 부터 원형질막으로 전위된 결과인지 아니면 다른 기전에 의한것인지를 확인하고자 실험에 착수하였다.

대조군과 간장암군 원형질막 분획을 분리한 다음 포도당 운반체의 강력한 경쟁적 억제자인[(3)**H]-cytochalasin B를 이용하여 포도당 운반체의 결합부위를 정량한 결과 cold cytochalasi B를 첨가하지 않았을때 대조군은 9,825±925 dpm/mg membrane protein이었고, 간장암군에서는 30,165±625 dpm/mg membrane protein으로 3'-Me DAB에 의해 유발된 간장암 세포 원형 질막의 포도당 운반체 양이 정상간장에 비해 3.1배 중가된 결과를 얻었다. Coldc cychalasin B의 농도를 증가시키면서 [(3)**H] -cytochalasin B가 결합되는 양을

정량한 후 Scatchard plot를 이용하여 분석한 결과 대조군과 간장암군의 원형질막에 존재하는 포도당 운반체의 양은 각각 5.0과 16.O pmol/mg membrane protein이었고, 이들의 해리 상수값은 각각 151 nM과 157 nM 이었다. 이러한 결과는 대조군에 비해 3'-Me DAB에

의해 간장암이 유발된 경우 포도당 운반체가 질적으로 변화 했다기 보다는 숫적으로 많이 표현되는 사실을 시사한다. 반응 속도론적 분석 결과를 보다 분명하게 밝히기 위해 photoaffinity labeling 법으로 [(3)**H]-cytochalasin B를 포도당 운반체에 공유결합으로 결합시킨후 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 실시한 결과, 대조군과 간장암군의 원형질막 분획에서 분자량 45 kDa에 해당하는 gel slice No.13에서radioactivity가 가장 강하게 나타나는 것으로 보아 정상세포가 간장암 세포로 변형되어도 분자량이 동일한 포도당 운반체가 표현되는 사실을 알 수 있었고 대조군에 비해 간장암군에 포도당 운반체가 많이 존재하는 것을 관찰할 수 있었다. 반면에 low density microsome 분획에서는 동일한 분자량45 kDa에 해당하는 위치에서 대조군에 비해 간장암군의 radioactivity가 감소되는 상반된 결과를 얻었다.

이러한 결과는 insulin과 같은 hormone처리시나, Swiss 3T3세포에서 화학 발암 촉진제인 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)처리시나, virus에 의해 유도되는 변형과정에서 포도당운반체가 세포내 소기관으로 부터 원형질막으로 재배치 된다는 실험결과와

동일하게 화학 발암제인3'-Me DAB으로 간장암을 유발시킨 경우에도 low density microsome에서 세포 원형질막으로 재배치된다는 것을 시사한다. 그러나 화학발암제에 의해 암세포로 변형되는 과정에서 원형질막에 포도당 운반체 표현이 증가되는 것이 단지 포도당 운반

체의 전위기전에 의한것인지 아니면 transcription level에서의 조절과 같은 다른 기전에 의한 것인지에 대해서는 보다 많은 연구가 필요하다고 생각된다.

[영문]

The present investigation was attempted to study the mechanism of increased glucose transporter (GT) expression on the plasma membranes of hepatocarcinoma cells induced by 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene (3'-Me DAB). Cytochalasin B binding to plasma membrane fractions from control and 3'-Me DAB group in the

absence of cold cytochalasin B showed 9.825±925 and 30,165±625 dpm/mg membrane protein, respectively. GTs present on the plasma membrane fractions in control and 3'-Me DAB group were 5.0 and 16.0 pmol/mg membrane protein and their Kd values were 151 nM and 157 nM, respectively. These results suggest that the GTs in plasma membrane were increased in 3'-Me DAB group compared to control group. In contrast, the amounts of GTs measured by photoaffinity labeling technique using [3^^H]-cytochalasin B were 31,207, 11,702 dpm/mg low density microsomal protein in control and 3'-Me DAB group, respectively. These results suggest that GTs were translocated from low density microsome to plasma membrane during carcinogenesis. To estimate the molecular weight of GT and correlation of GT translocation with tumorigenesis, 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was carried out. Gel slice Ne.13 from plasma membrane fractions

corresponding to MW of 45 kDa showed 3 times as muchradioactivities in 3'-Me DAB group compared to control group. However, the radioactivities from 3'-Me DAB group were only one third of those from control group in low density microsomal fraction. These results indicate that increased glucose transport seems to be more likely due to the reciprocal redistribution of GTs between plasma membrane and low density microsomal membrane.