화학 발암물질에 의해 손상된 백서 간장 DNA의 수정기전에 관한 연구

Abstract

[한글]

생체내 DNA는 자외선이나 화학 발암물질들에 의해 손상을 받게 되고(Wheeler와 Skipper 1957; Setlow, 1966; Lilja 등, 1977; Lawson과 Birt, 1983), 손상을 받은 DNA는 다시 정상적인 DNA로 수정된다(Lieverman 등, 1971; Cox와 Irving, 1975; Friedberg등, 1977; Ishikawa등, 1982)고 알려져 있으나 이에 대한 상세한 기전은 아직 확실치 않다. 본 연구에서는 자외선(UV)과 alkylating agent인 methylmethanesulfonate(MMS), 그리고 간암 유발물질인 3'-methyl-4-dimehtylaminoazobenzene(3'-Me DAB)을 E. coli DNA에 처리하여 생

기는 DNA손상 형태를 HPLC로 분석하고 손상을 입은 이들 DNA를 수정하는데 관여하는 효소들을 백서 간장 핵으로부터 분리하여 기질에 대한 특이성과 분자량 등 효소의 특성을 규명하여 자외선과 화학 발암물질에 의해 손상된 DNA의 수정에 이들 효소가 어떻게 관여하

는지 알아보고자 하였다. MMS(0.3M)는 E. coli DNA의 guanine No. 7과 adenine No. 3 위치에 주로 methylation시켰으며, 3'-Me DAB은 DNA의 guanine과 adduct를 형성하고 있음을 확인하였다. E. coli DNA에 자외선(500 joules/㎡)을 조사한 결과, 전체 thymine의 5%에 해당하는 thymine이 thymine dimer를 형성하였고 apurinic DNA(AP DNA)는 형성되지 않았다. 백서 간장 핵에 존재하는 DNA N-glycosylase는 methylate된 DNA에만 특이하게 작용하여 methylation된 염기를 제거하였으며 pyrimidine dimer DNA나 3'-Me DAB DNA adduct에는 작용하지 않았다. 백서 간장핵에는 두가지 형태의 AP DNA endonucleases(AP Ⅰ, AP Ⅱ)가 존재하였으며 이중 AP Ⅰ은 AP DNA에만 특이하게 작용하였고 AP Ⅱ는 AP DNA, UV DNA 그리고 3'-Me DAB DNA adduct에 공통적으로 작용하는 다양한 기질 특이성을 가지고 있었다. AP DNA endonuclease(AP Ⅰ)를 백서 간장 핵으로부터 24배 순수분리 하였으며 수율은 9.4%이었다. 순수분리된 효소의 specific activity는 62.5 units/mg protein이었고 분자량은 30,000 daltons인 단일 polypeptide이었으며 등전점은 7.2이었다. AP Ⅱ는 아직 순수 분리되지 않았으나 분자량이 대략 14,000 daltons인 polypeptide로 추정되었다. 이상과 같은 결과로부터 다음과 같은 결론을 얻었다. 자외선이나 확학발암물질에 의한 DNA의 수정기전 역시 서로 상이하며 methylation된 DNA수정에는 DNA-N-glycosylase와 AP DNA endonuclease가 관여하여 손상을 입은 DNA strand를 절단하고 pyrimidine dimer DNA나 3'-Me DAB DNA adduct의 수정에는 DNA N-glycosylase와 관계없이 직접 AP DNA endonuclease(AP Ⅱ)가 관여하여 수정하는 것으로 사료된다.

[영문]

Although it has been known that ultraviolet light(UV) or chemical carcinogens may cause the damage to DNA and the damaged DNA is repaired to normal DNA, the detailed repair mechanisms are not yet clear. In the present study, UV irradiation or methylmethanesulfonate(MMS), an alkylating agent and 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene(3'-Me DAB), a potent liver carcinogen, were treated to E. coli DNA and comparative patterns of DNA damage by these agents were analysed by HPLC. Enzymes involved in the repair of these damaged DNAs were isolated from rat liver nuclear fraction and were characterized in terms of substrate specificity and molecular weight in order to define possible roles of these enzymes in the pepair of DNA damaged by UV or chemical carcinogens.

Irradiation of UV(500 joules/m**2) on E. coli DNA formed thymine dimer in DNA(5% of total thymine) without the detectable apurinic DNA(AP DNA). MMS(0.3 M) methylated mainly on guanine No.7 and adenine No.3 positions and 3'-Me DAB was found to form a DNA adduct at guanine base. DNA N-glycosylase present in the rat liver nuclear fraction acted specifically on the methylated DNA to remove the methylated bases, however, it did not acted on pyrimidine dimer nor on 3'-Me DAB DNA adduct. There were at least two types of AP DNA endonuclease(AP Ⅰ, AP Ⅱ), and AP I acted

specifically on AP DNA and AP Ⅱ acted on UV DNA,3'-Me-DAB DNA adduct as well as on AP DNA, indicating that the latter has a broad substrate specificity. AP DNA endonuclease (AP Ⅰ) has been purified from rat liver nuclear fraction and the purified enzyme (AP Ⅰ) has a specific activity of 62.5 units/mg protein. It was

single polypeptide with a molecular weight of 30,000 daltons and with the PI value of 7.2. AP Ⅱ has not been purified yet, but its molecular weight was approximated to be 14,000 daltons. From these results, we have concluded as follows. The patterns of DNA damge caused by UV or chemical carcinogens are variable and the

repair mechanisms of damaged DNA are also different from each other. In the repair of the methylated DNA, DNA N-glycosylase and AP DNA endonuclease are involved to excise the strand of methylated DNA, however in the repair of pyrimidine dimer DNA

or 3'-Me DAB adduct, AP DNA endonuclease(AP ll) is involved.