Insulin에 의하여 유도되는 mRNA와 fatty acid synthetase합성에 관한 연구

Abstract

[한글]

백서를 굶기면 간장 세포 막의 insulin 수용체가 급격히 증가하며, 고함수탄소 식이를 재투여하여 혈액내 insulin이 증가하면 insulin과 수용체가 결합하여 그 복합체가 세포내로 신속히 이동되어 세포내의 insulin 농도가 증가하고, 이 증가된 insulin 이 핵막의 insulin 수용체와 결합하면 핵으로부터 mRNA efflux를 증가시켜 증가된 mRNA가 lipogenic enzyme의 생합성을 증가시키는 요인이라고 시사한 바 있으며(Whang등, 1982; Yoon등, 1983), 그 중 glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH)를 합성하는 mRNA가 증가되어 G-6-PDH 합성증가가 일어나는 기전을 일부 밝힌 바 있다(Kim등, 1985). 이에 저자는 insulin이 간장 세포내에서 어떤 기전에 의하여 lipogenic enzyme의 하나인 fatty acid synthetase(FAS) 합성을 증가시키는지 구명코자 본 연구를 실시하여 다음과 같은 실험 결과를 얻었다. 백서를 3일간 굶긴 다음 무지방 고함수탄소 식이로 2일간 재투여한 후 간장세포에서 FAS를 polyethylene glycol, DEAE-cellulose chromatography 및 Ultrogel AcA 34 gelfiltration을 실시하여, 16배 정제분리 하여서 specific activity가 mg당 1.43units인 FAS를 분리하였다. 이 효소용액을 SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 시행한 결과 단일 단백질대가 나타난 사실로 미루어 순수 정제 분리된 단일 효소임을 확인하였다. 전기영동상에 단일 단백질대로 나타난 효소를 사용하여 토끼에서 얻은 항혈청으로 Ouchterlony double immunodiffusion 실험을 한 결과 항 혈청 15㎕와 순수분리된 FAS와 5% polyethylene glycol로 추출된 간장 균등액과 작용하여 깨끗한 침전대를 형성하였으며 이들 침전대는서로 연결된 것으로 보아 순수 분리된 FAS에 대한 항 혈청이 형성되었음을 확인하였다.

백서를 3일간 굶긴 다음 대조군, 포도당 단독 처리군, insulin과 포도당 동시 처리군 및고함수탄소 식이 재투여 군으로 나누어, 각 군의 백서 간장 세포에서 mRNA를 분리하여 시험관 내에서 mRNA dependent reticulocyte lysate와 더불어 19개의 아미노산과 [(3)**H ]-leucine을 첨가하여 단백질을 합성시킨 후 FAS에 대한 항 혈청으로 침전시켜 합성된 FAS의 radioactivity를 측정한 결과 대조군에 비하여 포도당 단독 투여군은 1.5배, insulin과 포도당 동시 투여군은 8.5배, 고함수탄소 재투여군은 16배가 증가하였다. 이 실험 결과로 3일간 굶긴 백서에 insulin 및 고함수탄소를 재투여하면 혈중내 insulin이 증가됨에 따라 간장 세포막의 insulin 수용체를 통한 증가된 세포 내 insulin이 핵막의 insulin수용체와 결합하면 핵으로부터 mRNA efflux를 자극하여 세포질내 증가된 mRNA에 의하여 FAS합성이 증가한다는 사실을 확인하였다.

이상과 같은 실험결과로 미루어 보아 백서를 오랫동안 굶긴 후 고함수탄소 식이를 재투여 했을 때 나타나는 lipogenic enzyme들의 합성증가는 혈액내 포도당 농도 증가로 insulin 분비가 증가되고, insulin수용체를 통한 세포내 insulin농도가 증가하고, 증가된 insu

lin은 핵막에 증가된 insulin 수용체와 결합하여 핵으로 부터 mRNA efflux를 자극하여 세포질내 mRNA가 증가되고, 이중 FAS를 합성하는 mRNA에 의하여 FAS 생합성이 증가되는 작용 기전의 일부를 실험적으로 구명하였다.

[영문]

It has been suggested that the number of insulin receptors of liver plasma membrane in fasted rats would be increased and the circulating insulin levels would result in increase of intracellular insulin concentration by receptor-mediated

endocytosis when the fasted rats were refed high carbohydrate diets, and the increased intracellular insulin level in turn increases the efflux of mRNA by binding with insulin receptors on nuclear envelope, thereby causing the increase in biosynthesis of lipogenic enzymes including G-6-PDH.

The present study was undertaken in order to obtain an information on the mechanism by which the insulin increases the intracellular biosynthesis of another lipogenic enzyme, fatty acid synthetase, in rat liver. The results sumarize as follows: from livers of rats fed high carbohydrate lipid free diet for 2 days after 3 days fasting. fatty acid synthetase was purified 16 fold by a series of steps including polyethylene glycol extraction, DEAE-cellulose and Ultrogel AcA 34 gel filtration chromatography. The purified enzyme had a specific activity of 1.43 units/mg and showed a single protein band on SDS-polracrylamide gel electrophoresis indicating the homogeneity of the prctein. The purified enzyme was used to obtain rabbit antiserum and the reactivity of the antiserum was shown to be specific for fatty acid synthetase by Ouchterlony double immunodiffusion analysis. The antiserum was used to precipitate fatty acid synthetase synthesized in vitro using mRUA separated from the livers of rats which were divided into 4 groups. control group.

glucose treated group, insulin with glucose treated group and high carbohydrate group after 3 days fasting. The in vitro protein synthesis system contained 19 amino acida except leucine, [(3)**H ]-leucine and mRNA dependent reticulocyte lysate. After translation. the immunoprecipitate was electrophoresed using 5%

SDS-polyacrylamide gel, and the amount of synthesized enzyme was measured by radioactivity of the gel slice correspoding to the authentic fatty acid synthetase,and the results showed that the synthesized fatty acid synthetas e was increased 1.5 fold, 8.5 fold, 16 fold in glucose treated group, insulin with glucose treated group, high carbohydrate group, respectively. when compared to control group.

The present results indicate that high carbohydrate refeeding increased insulin level which in turn increased mRNA of fatty acid synthetase causing the increase in the biosynthesis of fatty acid synthetase in fasted rat liver.