제 1형 당뇨병 동물모델에서 Single-Chain Insulin Analog를 이용한 유전자 치료

Abstract

[한글]The development of type 1 diabetes results from the almost total destruction of insulin-producing pancreatic βcells by β cell-specific autoimmune responses. Standard insulin therapy may not maintain blood glucose concentrations within the relatively narrow range that occurs in the presence of normal pancreatic β cells. The cure of diabetes has long been sought using several different approaches, including islet transplantation, regeneration of β cells and insulin gene therapy. However, permanent remission of type 1 diabetes has not yet been satisfactorily achieved.

We approached the long-term cure of type 1 diabetes by using a recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing a single-chain insulin analog (SIA), which possesses biologically active insulin activity without enzymatic conversion from proinsulin to insulin, under the control of hepatocyte-specific L-type pyruvate kinase (LPK) promoter, which regulates SIA expression in response to blood glucose levels.

SIA produced from the gene construct (rAAV-LPK-SIA) can remit diabetes in streptozotocin-induced diabetic rats and autoimmune non-obese diabetic (NOD) mice for a prolonged time without the action of endogeneous pancretic insulin. SIA expression by LPK promoter could be tightly regulated in response to blood glucose level and the treatment of normal control SD rat with rAAV expressing SIA did not reveal hypoglycemia. Although the difference in kinetics between insulin of normal control group and SIA of rAAV-LPK-SIA-treated group in response to glucose loading, rAAV-LPK-SIA-treated group maintained normoglycemia in non-fasting state. These data indicate that SIA expression was properly regulated in response to physiological stimuli and the other homeostasis system might contribute to the maintenance of normoglycemic state. Especially Glycolytic enzyme of rAAV-LPK-SIA-treated rats was rapidly changed at transciption level in response to glucose loading and it might participate in the regulation of blood glucose level. Through this study, the treatment of both chemically induced diabetes in rats and autoimmune diabetes in mice with rAAV expressing the SIA resulted in the permanent remission of type 1 diabetes. The treatment of autoimmune NOD mice with rAAV expressing the SIA resulted in the permanent remission of type 1 diabetes without any detectable adverse effect on the hepatocytes, suggesting that this novel gene therapy may have therapeutic value for the cure of type 1 diabetes in humans. But to realize this therapy and use for the human, it should be applied to the large animal which is evolutionally close to the human and evaluated its possibility.

[영문]제 1형 당뇨병은 인슐린을 분비하는 췌장베타세포의 파괴가 림파구에 의해 이루어지는 일종의 자가면역질환으로 절대적인 인슐린의 결핍현상을 나타낸다. 제 1형 당뇨병의 주된 치료방법으로는 매일 2회 이상의 인슐린 투여가 이루어지고 있으나 이러한 방식으로는 생리적 자극에 따라 다양하게 변화되는 인슐린의 요구량을 정확하게 충족시키기가 어렵기 때문에 고혈당이나 저혈당상태에 방치되기가 쉽다. 특히 장기간 고혈당이 지속되면 여러 기관에 세포상해를 일으켜 만성 합병증을 일으키기 쉽기 때문에 이렇게 외부의존적으로 이루어지는 인슐린의 투여가 제 1형 당뇨병의 완벽한 치료법이라고 말하기는 어려운 실정이다. 다른 한편에서는 제 1형 당뇨병 환자의 체세포에서 유전자 치료에 의해 인슐린 분비능을 회복시키고자 하는 시도들이 이루어지고 있는데 이러한 치료시도는 기존의 혈당강하제와 비교할 때 자체적인 인슐린 분비기능 회복이라는 측면에서 보다 근본적인 치료방법으로 생각되어지며 장기이식보다 더 광범위하게 적용되어질 수 있을 것으로 사료된다. 이러한 치료법이 성공하기 위해서는 첫째, 유전자치료에 있어서 적합한 대상세포의 선정이 이루어져야 하고 둘째, 기존의 프로인슐린보다 혈당강하능력이 뛰어난 mutant 프로인슐린이나 인슐린이 치료유전자로 사용되어야 하고 셋째, 이러한 치료유전자의 발현과 분비는 혈당농도에 의해 정확하게 조절되어야 하며 넷째, 생체 내에서 치료유전자의 발현이 장기간 이루어질 수 있는 효율적인 유전자전달체계를 이용하여야 한다.

따라서 본 연구에서는 프로인슐린에서 인슐린으로의 효소적 전환 과정을 거치지 않고도 생체 내에서 뛰어난 혈당강하능력을 가지는 mutant 프로인슐린 (single-chain insulin analog, SIA)을 개발하여 치료유전자로 사용하였고, 간세포에서 혈당농도의 변화에 따라 SIA의 발현이 장기간 안정적으로 조절될 수 있도록 간세포 특이적인 L-type pyruvate kinase (LPK) 프로모터와 재조합 adeno-associated virus (rAAV) vector system을 이용하여 유전자치료를 시도하였다. 그 결과, 스트렙토조토신의 처리에 의해 인위적으로 당뇨병을 유발시킨 당뇨백서모델이나 자가면역반응에 의해 당뇨병이 발증된다고 알려져 있는 non-obese diabetic (NOD) mice 모델에서 SIA를 이용한 유전자치료를 통해 장기간 안정적인 혈당의 교정이 가능하였으며, 췌장에서 분비되는 내재적인 인슐린의 작용을 완전히 배제하고도 간장에서 발현, 분비되는 SIA 만으로 정상혈당이 유지될 수 있었다. 간장에서 LPK 프로모터에 의한 SIA의 발현은 혈당농도의 변화에 따라 엄격하게 조절되었으며, 특히 정상대조백서에 재조합 virus particle을 주입한 경우에도 저혈당현상이 관찰되지 않았다. 복강내 당부하검사 결과 정상대조군과 당뇨치료군은 서로 상이한 반응양상을 나타내었지만 비 공복상태에서는 당뇨치료군이 항상 정상혈당농도를 유지하고 있는 것으로 보아 SIA의 발현은 생리적 자극에 따라 잘 조절되고 있으며, 이 밖에도 정상혈당의 유지를 위하여 생체내의 다른 homeostasis system의 도움을 받고 있는 것으로 생각된다. 특히 정상대조백서와 비교하여 당뇨치료백서에서 당 부하에 따른 당 분해효소들의 전사단계에서의 빠른 양적 변화는 혈당농도의 조절에 어느 정도 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구에서는 제 1형 당뇨병 실험동물모델에서 SIA를 이용한 유전자치료를 통해 생리적 자극에 따른 정교한 혈당교정이 이루어질 수 있음을 증명하였다. 특히 사람에서의 제 1형 당뇨병과 유사한 발병기작에 의해 당뇨병이 발증된다고 알려져 있는 NOD mice 모델의 경우 간세포에서 장기간 SIA가 발현됨에도 불구하고 별다른 면역반응이 유발되지 않았다는 사실은 SIA를 이용한 유전자치료책이 사람에게도 치료적 가치를 가질 수 있음을 시사한다. 그러나 앞으로 이러한 개념의 치료를 보다 구체화하고 사람의 당뇨병 치료에 도입하기 위해서는 좀 더 사람과 유연관계가 가까운 대동물에 적용하여 그 가능성을 타진해 보아야 할 것으로 생각된다.