폐암 세포주에서 lovastatin이 세포성장에 미치는 영향

Abstract

[한글]세포의 성장과 증식은 세포주기의 진행을 통하여 이루어진다. 세포주기는 여러 가지 인자들에 의해 조절이 되는데 이중 세포주기 조절 단백질인 cyclin과 cyclin-dependent kinase (Cdk)의 복합체는 세포주기의 진행을 촉진하며, Cdk inhibitor (CKI)는 이 복합체와 결합하여 작용을 억제하는 역할을 한다. 악성 종양에서는 이러한 조절 작용이 균형을 잃고 과도한 세포 성장이 일어나게 된다.

Lovastatin은 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase의 길항 효소로서 고지혈증 치료제로 개발된 약제인데 세포주기의 정지 및 세포성장의 억제를 일으키는 작용이 알려져 최근에는 항암요법 또는 화학 예방요법제로서의 역할이 대두되고 있다. Lovastatin이 세포주기에 작용하는 주요 기전은 G1-S기 전환에 주로 작용하는 CKI인 p21과 p27을 유도하여 Cdk를 억제하고 그 결과 G1기 정지 및 세포성장의 억제를 일으키는 것으로 알려지고 있으며 이러한 작용은 여러 가지 세포주에서 연구가 되었으나 세포주기 조절 단백질의 구체적인 발현 변화의 양상에 있어서는 세포주의 종류에 따라 다소의 차이를 보인 바 있다. 또한 최근에는 lovastatin이 세포주기의 정지뿐만 아니라 세포사멸을 일으키는 작용이 있는 것으로 보고되고 있다. 폐암에 있어서는 lovastatin이 세포성장에 미치는 영향에 대한 연구가 일부 있었으나 구체적인 작용이나 기전에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 연구자는 폐암 세포주 A549, NCI-H23 및 Calu-3에서 lovastatin 처리후의 세포주기 및 세포증식 양상의 변화를 관찰하고 세포주기 조절 단백질의 발현 변화를 조사하였으며, 세포사멸에 대한 실험을 하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. Lovastatin 처리 후 A-549 및 NCI-H23 세포주에서 세포사를 동반한 형태적 변화가 나타났으며, Calu-3 세포주에서는 변화가 미약하였다.

2. 유세포분석의 결과 전 세포주에서 저농도의 lovastatin (1, 3 μM) 처리 시에는 G2/M기의 증가를 보였고 고농도의 lovastatin (10, 30 μM) 처리 시에는 더 현저한 G1기의 증가가 나타났다.

3. p53의 유무에 관계없이 p21은 전사 항진에 의한 단백질의 발현 증가를 보였으나 p27은 유의한 변화가 없었다. Cdk2는 단백질의 양적인 변화는 없었으나 kinase assay 결과 효소 활성도가 감소되었다. Cdk2/p27 복합체가 현저히 증가하였으며, Cdk2/p21도 발현 증가를 보였다.

4. Cyclin B1은 전사 억제에 의한 발현 감소가 있었고 Cdc2는 단백질의 양적인 변화는 없었으나 kinase assay상 효소 활성도의 감소가 나타났다.

5. 전 세포주에서 DNA fragmentation이 나타났고 NCI-H23에서 가장 현저하였다. NCI-H23에서 p21에 대한 Western blot 상 15 kDa 부위에 p21의 절단에 의한 band가 나타났다.

이상의 결과에서 lovastatin은 폐암 세포주에서 세포성장의 억제 및 세포사를 일으켰고, 이때 세포사의 현상은 p21의 절단 작용에 의한 세포사멸이 관여하는 것으로 나타났다. 세포주기에서는 현저한 G1기 정지와 상대적으로 미약한 G2기 정지 및 이에 상응하는 세포주기 조절 단백질의 발현 변화를 관찰할 수 있었다. 특히 G1기 정지작용은 p53의 유무에 관계 없이 lovastatin이 CKI를 유도하는 작용이 주요한 기전으로 나타났고 이때 p21은 전사 증가에 의한 단백질의 양적인 증가가 있었으나 p27은 자체의 양적인 변화는 없이 Cdk2와의 결합 증가가 나타났다.

핵심되는 말: 폐암, 세포주, lovastatin, 세포성장, 세포주기 조절 단백질, 세포사멸, p21, p27

[영문]The cell growth and proliferation are characterized by the progression through the cell cycle which is orderly controlled by the interactions of various cell cycle regulatory proteins. The cyclin and the cyclin-dependent kinase (Cdk) form heterodimeric complexes which activate the cell cycle progression. Cdk inhibitors (CKI) negatively regulate the cell cycle by binding with cyclin/Cdk complexes.

Lovastatin is a potent inhibitor of 3-hydroxy-3-methyglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase and has been originally used to treat hypercholesterolemia. It also has the ability to induce G1 arrest in the cell cycle resulting in growth inhibition. Lovastatin is under clinical trial as a potential anticancer and chemopreventive agent. Main mechanism of lovastatin in cell cycle blockage is considered to induce CKI such as p21 and p27 followed by inhibition of cell cycle regulatory proteins. Many studies concerning the effects of lovastatin on the cell growth have shown various results in detailed mechanisms of action, especially in expression of the cell cycle regulatory proteins. The biologic effects of lovastatin on the lung cancer cell lines were studied by evaluating the alterations of cellular morphology, cell cycle and expression of cell cycle regulatory proteins, which revealed following results.

1. After lovastatin treatment, morphological changes with cell death were demonstrated in A549 and NCI-H23 but rarely in Calu-3 cell line.

2. Flow cytometric analysis showed marked increase in the G1 proportion by higher doses of lovastatin and less degree of increase in the G2/M phase by lower doses.

3. Lovastatin treatment increased protein and mRNA levels of p21 regardless of p53 status but p27 showed no significant change. Cdk2 kinase activity was reduced and increased bindings of CKIs, especially p27 with Cdk2 were noted.

4. Protein and mRNA levels of cyclin B1 were decreased with reduced kinase activity of Cdc2.

5. DNA fragmentation was found in all cell lines, especially in NCI-H23 which is accompanied by appearance of 15 kDa band of p21 cleavage fragment on Western blot analysis using anti-p21 antibody.

These results demonstrate that lovastatin induces growth arrest of lung cancer cell lines in which the process of apoptosis is considered to play a role, and causes cell cycle arrest mainly in G1 phase but less degree of G2 arrest was also found with corresponding alterations of the cell cycle regulatory proteins. Induction of p21 by lovastatin is of transcriptional activation but p27 inhibits Cdk2 activity mainly by increased binding rather than increase of its own expression.

Key Words: lung cancer, cell line, lovastatin, cell growth, cell cycle, cell cycle regulatory protein, apoptosis, p21, p27