백서 간장 세포질내 NADP-ICDH의 물리 화학적 성질 및 반응속도에 관한 연구

Abstract

[한글]

동물 조직에는 두 종류의 isocitrate dehydrogenase가 존재한다고 보고되어 있다. 즉 NAD-dependent isocitrate dehydrogenase(NAD-lCDH, EC 1.1.1.41)는 세포질과 mitochondria에 존재하고 NADP-dependent isocitrate dehydrogenase (NADP-lCDH, EC 1.1.1,42)는 세포질과 mitochondria에 동시에 존재한다(Plaut 1963). NAD-lCDH는 분자량이 340,000이고(Giorgio등, 1970)분자량이 40,000인 소단위로 구성되어 있으며 (Shen등, 1974) AMP와 ADP에 의해 활성이 측진되며 ATP와 NADH에 의해 활성이 억제되는 allosteric enzyme으로서 TCA(tricarboxylic acid) cycle의 중요한 조절 효소로 알려져 있다(Plaut 1970). 그러나 NADP-lCDH는 분자량이 90,000이하인 효소로써 종에 따라 하나 또는 두 개의 소단위로 구성되어 있으며 (Chung과 Franzen 1969; Colman등, 1970: Carlier와 Pantaloni 1973) 세포질과 mitochondria에 동시에 존재하나 심장과 골격근육에는 주로 mitochondria에, 간장세포에는 주로 세포질에 존재한다고 보고되어 있다(Pette 1966). 이 효소는 돼지심장(Siebert 1957), 소심장(Macfarlane등, 1977), Azotobacter vinelandii(Chung과 Franzen 1969)에서 순수정제 분리 보고되었으나 백서 간장세포에서는 아직 순수 분리되어 있지않다. 이에 본인은 백서 간장세포에서 이 효소를 순수 분리하고 분자량, 소단위 구성여부, 물리 화학적 성질 및 kinetic study를 실시하여 다음과 같은 성적을 얻었다.

1. 백서 간장세포내 NADP-lCDH의 분리정제

NADP-lCDH는 황산암모늄 처리, 열 처리, Sephadex G-150, 두번의 DEAE-Sephadex A-50 이온 교환 chromatography를 통하여 480배 분리정제 하였다. 분리정제된 백서 간장세포의 NADP-ICDH의 specific activity는 76.9μmoles/min/mg protein이었고 이때 효소 활성은

5.2% recover되었다. 480배 분리정제된 이 효소가 disc-gel electrophoresis와 SDS-gel electrophoresis에서 단일 단백질 band로 나타난 사실로 미루어 이 효소는 순수 분리정제 되었음을알 수 있다.

2. 백서 간장세포내 NADP-lCDH의 분자량 및 구성단위

백서 간장세포 NADP-lCDH는 SDS-polyacrylamide gel(7.6%) 전기영동에서 단일 단백질 band로 나타났으며 분자량은 약 45,000으로 계산되었고 Sephadex G-150 gel filtration chromatography에서는 분자량이 90,000으로 계산 되었다. 이 결과는 백서 간장세포 NADP-lC

DH는 두개의 동일한 소단위로 구성되어 있음을 시사한다.

3. 백서 간장세포내 NADP-lCDH의 물리 화학적 성질 및 반응속도

(1) 온도가 효소 활성에 미치는 영향

NADP-lCDH의 초기 반응속도는 40℃까지 증가되었으며 그 이상의 온도에서는 효소 활성이 감소되었다. 25℃와 35℃사이의 Q**10(온도계수)은 1.57이었다.

(2) PH가 효소 활성 및 안정도에 미치는 영향

효소 활성은 PH 7.4까지 증가하다가 그 이상의 pH에서 활성이 감소 되었으며 최적 pH는7.4±0.2이었으며 pH6.0에서 PH 8.0에 걸쳐 안정하였다.

(3) 염류(salts)가 효소 활성에 미치는 영향

여러종류의 염 용액에서 효소 활성을 정량한 결과 효소 활성은 염 농도가 0.9M일때 까지는 영향이 없었으나 그 이상의 농도에서 효소 활성이 감소되기 시작하여 ammonium sulfate는 농도가 1.8M에서 원래 활성의 50%, sodium sulfate는 1.8M에서 32%, ammonium chloride는 20%가 감소되었다.

(4) 2가 양이온이 효소 활성에 미치는 영향

Mn^^++(0.24, 2.42mM) 존재하에서의 효소 활성을 각 100%로 기준 할 경우 Mg^^++(0.24, 2.42mM)은 각 해당농도의 54.5%의 활성을 나타냈으며 Zn^^++을 첨가했을 경우에는 효소 활성이 나타나지 않았다. 금속이온이 없으면 효소 활성도 없었다. 이 결과는 NADP-lCDH는 금속이온을 필요로하며 특히 Mn^^++-isocitrate complex가 기질로 작용하는 효소임을 시사하고 Zn**++은 chelator로 사료된다.

4. Km치 측정 및 반응속도

DL-isocitrate의 농도를 각각 0.075mM, 0.15mM, 0.3mM, 0.6mM로 고정하고 NADP**+의농도를 3.03에서 33.3μM까지 변화시키면서 초기 반응속도를 측정하여 double reciprocalplot, slope replot 및 1/v axis intercept를 replot하여 Km치를 계산한 결과 DL-isocitrate에 대한 Km치는 54μM, NADP**++에 대한 Km치는 4.28μM이었으며, 이 효소는 ordered BiBi반응 기전에 의한 촉매 작용을 하는 효소로 사료된다.

[영문]

NADP-isocitrate dehydrogenase (NADP-ICDH, EC 1.1.1.42) has been purified 480 folds from rat liver by a combination of ammonium sulfate fractionation, Sephadex G-150 gel filtration and DEAE-Sephadex A-50 ion exchange chromatography. A single band of this enzyme was obtained by polyacrylamide disc-gel (7.0%) electrophoresis and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis suggesting that the enzyme is homogeneous. Physical and chemical properties of the enzyme have been determined.

The molecular weight measured by gel filtration of stud Sephadex G-150 and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was 90,000, which consists of two identical subunits having molecular weight of about 45,000. The reaction rate increased linearly with temperature up to 40℃; further increase in temperature resulted in al falling off of an initial velocity. Q^^10 between 25℃∼35℃ was found to be 1.57.

The enzyme was stable over a range of pH 6.0∼8.0 with a sharp fall in stability beyond this enzyme showed no activity. The maximum activation of enzyme was obtained by the addition of Mn**++. In the presence of Mg**++(0.24, 2.42mM), 54.5% of the activity was found when the enzyme activity is expressed as 100% in the presence of Mn**++(0.24, 2.42 mM)

This indicated that the enzyme requires a divalent metal ion for activity. However, added enzyme while Mn**++ is an essential cofactor for substrate for the enzyme activity indicating that Zn**++ is a 초딤색 of the enzyme while Mn**++ is an essential cofactor for substrate for the enzyme activity. The enzyme did not show any significant increase or decrease in activity by any of the salt concentrations up to 0.9 M. But enzyme activities were decreased slowly as salt concentrations were increased above 0.9 M and 50% decrement of original enzyme activity by ammonium sulfate, 32% decrement by sodium sulfate, 20% decrement by ammonium chloride were observed with each salt concentration of 1.8 M. The Km values for DL-isocitrate and NADP**+ were 54 μM and 4.28 μM, respectively. These kinetic datasuggest, therefore, that the enzyme catalyzes the reaction by ordered BiBi reaction mechanism.